Аппараты для культивирования микроорганизмов-продуцентов
Ферментеры, или биореакторы, представляют собой камеры, в которых в жидкой или на твердой среде выращивают микроорганизмы. Процесс, происходящий в ферментере, называется ферментацией. Термин ферментация первоначально применялся только к анаэробным процессам, однако сейчас он используется более широко и включает все процессы, как аэробные, так и анаэробные. Продуктом являются либо сами клетки (биомасса), либо какой-то полезный клеточный метаболит. Все операции должны проводиться в стерильных условиях, чтобы избежать загрязнения культуры. Кроме того, необходимо обеспечить возможность поддержания в стерильном состоянии всех вводных и выводных отверстий . Аппаратура для выращивания микроорганизмов, стерилизации и других микробиологических целей
1. Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов 37°С. Термостаты бывают суховоздуш-ными и водяными Используются для культивирования микроорганизмов.
2. Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.
3. Сушильный шкаф (печь Пастера). Предназначен для стерилизации лабораторной посуды и других материалов.
4. Автоклав. Предназначен для стерилизации паром под давлением В микробиологических лабораториях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, переносные).
5. Холодильники. Используются в микробиологических лабораториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, вакцин, сывороток и прочих биологически активных препаратов при температуре около 4°С. Для сохранения биопрепаратов при температуре ниже 0°С используются низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура -20°С и ниже.
Источник
Аппаратура и устройства для культивирования микроорганизмов
Для культивирования микроорганизмов (микробы, риккетсии, вирусы, грибы) необходимы и широко используются термостаты специального назначения, имеющие различные габариты и пределы регулирования температуры. Термостатирующие устройства могут быть как сухожаровыми, так и с водяным обогревом. В некоторых моделях термостатов предусмотрено устройство для подачи и равномерной циркуляции CО2 и воздуха, что позволяет использовать термостат как для аэробных, так и для анаэробных микробов [28].
Серию лабораторных термостатов специального назначения выпускает фирма «Feinmechanik—Optik» (ГДР). Бактериологические инкубаторы этой фирмы —„104″, BS-2, WS-2—предназначены для выращивания и хранения бактериальных и вирусных культур [3]. Рабочий диапазон температур термостата BS-2 — в пределах от +30 до +100°С. Точность регулирования температуры ±0,1° С. Рабочее пространство камеры (высота, ширина, глубина) —400X440X400 мм, емкость — 70 л. Напряжение питания — 220 В, 50 Гц, потребляемая мощность — 880 Вт. Общая высота — 580 мм, масса — 63 кг.
Фирма «Millipore» [24] выпускает малогабаритный лабораторный термостат, который может быть использован и в полевых условиях. В термостате автоматически поддерживается температура в заданном режиме с погрешностью ±0,5°С. Температура может устанавливаться в пределах от +18 до +60°С. В термостатах может помещаться до 50 специальных чашек с питательной средой, выпускаемых фирмой, или 35 обычных чашек Петри. Питание — от батарей постоянного тока. Масса — 8,2 кг.
Развитие исследований по микробиологическому синтезу ставит перед специалистами многочисленные задачи, одна из которых — разработка аппаратуры и систем непрерывного культивирования микроорганизмов.
Наращивание темпов научных исследований в области микробиологии, физиологии и биохимии микроорганизмов привело в нашей стране, в шестидесятых годах, к разработке и изготовлению комплексных установок — таких, как «Биостенд» (институт физики СО АН СССР), АНКУМ-1 — комплекса аппаратуры для непрерывного культивирования микроорганизмов (СКВ биологического приборостроения АН СССР), однако в настоящее время вопрос о массовом оснащении научных учреждений лабораторными ферментационными установками еще не решен. Ферментеры — приборы, предназначенные для непрерывного культивирования бактерий. Выпускаются в виде больших (стационарных) и малых лабораторных установок. В ферментерах обычно имеются устройства для подачи в микробную массу при ее культивировании кислорода для аэрации, для непрерывного перемешивания микробной массы, для измерения и регулирования рН среды, поддержания определенной температуры.
Представляет несомненный интерес отечественный аппарат АК-10 для глубинного ферментирования микроорганизмов [4].
В ферментере рабочей емкостью 5 л осуществляется автоматическая стабилизация температуры питательной среды, ее аэрирование и перемешивание. Воздух, предварительно очищенный от механических примесей, подается к аппарату под давлением 1,4 кг/см 2 через регулирующий клапан, индикатор расхода и биофильтр. Ввод воздуха производится через форсунку с обратным клапаном, предотвращающим попадание клеточной суспензии в воздушный клапан при прекращении аэрации. Система ротаметров позволяет регулировать поток воздуха. На выходе отработанного воздуха имеется конденсационный сосуд с фильтром для предотвращения попадания клеток в рабочее помещение.
Перемешивание осуществляется турбинной мешалкой, насаженной на вал привода. На верхней части вала мешалки укреплен диск механического пеногашения, препятствующий подъему пены к выходным штуцерам.
Для отбора проб и работы с проточными датчиками, например с датчиком оптической плотности клеточной суспензии, в аппарате АК-Ю имеется циркуляционный насос. В нагнетательном канале насоса установлен пробоотборный клапан. Конструкция прибора выполнена в виде несущего каркаса, на котором укреплен ферментер и вспомогательные устройства. Корпус ферментера изготовлен из термостойкого стеклянного цилиндра, ограниченного металлической крышкой и основанием. Крышка ферментера имеет 12 штуцеров для ввода в питательную среду добавок, титрующих агентов и пеногасителей. объем — 200 л) фирмы «Биотек» представляет собой новый тип устройства, предназначенного для стерилизации большого количества сред или для сбора и охлаждения выращенных культур микроорганизмов при использовании выпускаемых этой же фирмой ферментеров к аппаратам для непрерывного культивирования микробов [30.] Устройство оборудовано соединительными шлангами для подачи пара и воды и рассчитано на давление до 2 атмосфер (рис. 47). Устройство представляет собой сосуд, оборудованный рубашкой и помещенный на передвигаемую опору на колесах. Для перемешивания используется магнитная мешалка, приводимая в движение трехфазным электромотором. Рабочая скорость перемешивания у всех трех моделей фиксированная — 770 об/мин.
Рис. 47. Сосуд для хранения и транспортировки питательных сред МЛ-100.
Система терморегуляции обеспечивает плавное регулирование и поддержание температуры в диапазоне от 20 до 60° С, с точностью ±5° С. Число оборотов мешалки — от 50 до 1500± ±10% об/мин. Масса прибора — 65 кг.
Шведской фирмой «Biotec» выпускаются сосуды для хранения и транспортировки питательных сред. Серия аппаратов МЛ (MЛ-075, общий объем— 90 л, МЛ-100, объем — 160 л, МЛ-150,
Ряд зарубежных фирм выпускает комплекты ферментационного оборудования, которые оснащены устройствами и приборами, обеспечивающими автоматическое регулирование основных параметров процесса культивирования микроорганизмов.
В качестве примера такого устройства может быть приведена контрольная панель ЛП-300 с ферментером (рис. 48) шведской фирмы [27].
Рис. 48. Контрольная панель ЛП-300 с ферментером.
Панель обеспечивает контроль и поддержание в заданных пределах скорости перемешивания питательной среды, температуры и подачи газа, дозирования компонентов питательной среды. Противопенные препараты вводятся с помощью перистальтического насоса, который автоматически включается, если пенный пробоотборник определяет наличие пены.
Наибольшее распространение получили на международном рынке установки «Biotec», которые выпускаются в нескольких модификациях с ферментерами емкостью 1,3, 10 и 15 л [26]. Набор из отдельных функциональных блоков обеспечивает термостатирование, рН-статирование, химическое пеногашение, аэрацию и возможность ведения непрерывных процессов. Наибольшее распространение получили ферментеры типов ФЛ-103 и ФЛ-110 (рис. 49). Ферментер ФЛ-103 имеет полезный объем 1 и 3 л, а ферментер ФЛ-110 — 10 и 20 л.
Рис. 49. Ферментер ФЛ-110.
Ферментеры изготовлены из пирексового стекла. Дно и крышка ферментера выполнены из нержавеющей стали. Лабораторные ферментеры установлены на металлических ножках, что облегчает снятие дна и крышки ферментера и дает возможность присоединять к штуцерам, вмонтированным в дно прибора, датчиков различных приборов (рН-метра, измерителя оптической плотности, газоанализатора и др.), а также для введения добавок, титрующих агентов, пеногасителей.
Ферментер типа ФМ-100, выпускаемый фирмой «Biotec», является передвижной моделью и предназначается для ферментирования непатогенных бактерий. Ферментер состоит из собственно ферментера ФМ-100 с общим объемом около 150 л, с встроенным в дно устройством для перемешивания, и систем контроля температуры, подачи воздуха и стерилизации. Система подачи воздуха оборудована измерителем скорости подачи воздуха и фильтром для его очистки. Внешний вид прибора приведен на рис. 50.
Рис. 50. Ферментер ФМ-100.
Основные достоинства этого типа ферментера: перемешивающее устройство, вмонтированное в дно сосуда, облегчает манипуляции, перемешиватель легко вынимается и может быть установлен на любой необходимой высоте над дном сосуда. Мощный электромотор перемешивающего устройства имеет электронный контроль скорости вращения. Заглушки и воздуховоды легко удаляются, если необходима вихревая аэрация. Введение различных препаратов обеспечивается наличием пяти вводных отверстий на крышке. Взятие проб и введение дополнительных компонентов под поверхность жидкости обеспечиваются через входные отверстия с мембранами. Контроль температуры осуществляется электронным устройством. Имеется устройство для противопенного контроля и измерения рН.
Фирма «Biotec» выпускает миниферментер — портативное, компактное устройство, легко автоклавируемое, легко собираемое и быстро подготавливаемое к работе. С помощью миниферментера можно быстро получать культуры для их биохимического исследования. Значение температуры внутри сосуда емкостью 700 мл может выбираться в интервале от 20 до 60° С. Количество оборотов перемешивателя — от 100 до 2000 в 1 мин. В миниферментере легко могут быть использованы приспособления для дополнительного контроля рН, р02, что позволяет культивировать различные виды микроорганизмов как в аэробных, так и анаэробных условиях. Крышка миниферментера сделана из кислотоустойчивой нержавеющей стали и снабжена двумя патрубками для ввода и вывода воздуха и двумя отверстиями, закрываемыми резиновыми мембранами (пробками), что позволяет брать пробы, изменять кислотность среды, добавлять питательные вещества и т. д. без риска нарушить стерильность [26].
Предприятие «Glas KeramiK» (ГДР) выпускает ферментер для аэробных культур ФС/002 и для анаэробных культур ФС/003.
Оба автоклавируемых типа ферментера имеют цилиндрическую конструкцию из термостойкого стекла с двойной рубашкой, позволяющей проводить культивирование при необходимой температуре. Вдавленная крышка со стандартным шлифом снабжена пятью коническими шлифами, которые можно использовать для различных целей. Оба ферментера имеют водосливы, а на нижнем конце имеется устройство для отбора проб.
В вирусологических лабораториях находит все большее применение аппаратура, позволяющая получать большие количества клеточной массы. Примером такой аппаратуры может служить многодисковое устройство для получения тканевых культур, выпускаемое американской фирмой «New Brunswik» [29].
Внутри этого аппарата размещены вращающиеся титановые диски, увеличивающие площадь при данном объеме питательной среды, позволяя получать большие количества первичных клеток как для исследовательских, так и для промышленных целей, включая производство вакцин и сывороток. Выпускается в двух модификациях: на 4 л из стекла (рис. 51) и на 14 л из нержавеющей стали.
Рис. 51. Многодисковое устройство для получения тканевых культур.
Роллерные установки предназначены для культивирования тканевых культур при вирусологических исследованиях на внутренних стенках цилиндрических сосудов при вращении их на подвижных валиках (роликах) с различными скоростями. В этих условиях происходит орошение культуры, прикрепленной на внутренней стенке сосуда, а вместе с тем и более оптимальная аэрация, что способствует более эффективному размножению вируса.
Роллерный аппарат американской фирмы «Forma Scientific» предназначен также для получения клеточной массы в больших объемах, в одном слое в цилиндрических сосудах, вращающихся одновременно при различных скоростях (от 0,1 до 8 об/мин). Роллерные аппараты позволяют максимально использовать пространство для питательной среды и дают высокий выход клеток с квадратного сантиметра поверхности, обеспечивая хороший доступ кислорода и питательной среды к клеткам, создавая в конечном итоге значительную экономию времени при посеве, выращивании и сборе их [26].
Выпускаются роллеры различных моделей: от настольной, рассчитанной на 5—15 флаконов, до напольной с 7 полками, на каждой из которых можно разместить по 4 сосуда. Все модели оборудованы тахометрами, с погрешностью в пределах 1%, для контроля скорости вращения сосудов. Интервалы скоростей вращения могут изменяться от 0,1 до 4 об/мин. Аппараты оборудованы звуковой сигнализацией, включающейся при падении напряжения в сети или при отключении аппарата. На рис. 52, а, б, в представлены различные варианты роллерных устройств.
Рис. 52. Роллерные аппараты.
а, б — настольные варианты; в — напольный вариант
Помимо упомянутых зарубежных фирм, специализирующихся на выпуске лабораторного ферментационного оборудования, следует также упомянуть японскую фирму «Marubishi», английскую — «Gallenkamp» и швейцарскую «Chemap».
Фирма «Biotec» выпускает прибор (фирменное название «Х-пресс»), с помощью которого производится дезинтеграция клеток с большим выходом дезинтегрированной массы [31]. Прибор может найти применение в иммунологии и энзимологии.
Замороженный биологический материал при помощи гидравлического пресса продавливается через узкое отверстие в специальную камеру. Манипуляция с продавливанием может быть повторена несколько раз, в результате чего образуется достаточно дезинтегрированная клеточная масса, которая для количественного учета может подвергаться нефелометрированию на колориметре — нефелометре. Дезинтеграции могут подвергаться как любые бактериальные, так и тканевые клетки.
Для аналогичных целей фирмой MSE (Англия) выпущена модель ультразвукового дезинтегратора клеток (рис. 53).
Рис. 53. Ультразвуковой дезинтегратор клеток.
Принцип работы дезинтегратора основан на кавитационном действии ультразвуковой волны, распространяемой в жидкости, содержащей клеточную массу, в результате чего происходит разрушение микроорганизмов, клеток тканей и других биологических материалов. Прибор снабжен саморегулируемой настройкой, что позволяет поддерживать выработанную оператором частоту, амплитуду колебаний и мощность. Прибор может быть также использован в качестве ультразвуковой моечной машины для мытья мелкой капиллярной посуды.
Американская фирма «Millipore» предлагает ряд приспособлений и устройств для микробиологического анализа [23]. В частности, для микробиологического анализа крови человека, особенно при подострой бактериемии, когда на выдачу анализа в обычных условиях уходит несколько суток, используют аппарат, показанный на рис. 54. Аппарат выпускается с набором специальных фильтров, являющихся основой всего комплекта. Каждый из фильтров набора обладает ингибирующим действием против того или иного вида микроорганизмов, в результате чего после фильтрации крови на фильтре, помещенном на питательную среду, вырастают колонии, полученные селективным методом. Учитывая, что результаты анализа можно определять уже через 24 ч, а сама подготовительная процедура не требует много времени, можно рекомендовать эту или аналогичную ей аппаратуру для широкого применения в микробиологической практике.
Рис. 54. Прибор для анализа и подсчета микробных колоний.
Источник