Бактериологическое исследование почвы проводят

Бактериологическое исследование почвы проводят

Санитарно-бактериологическое исследование почвы — Н. А. Бельская

Почва является основным местом обитания многих микроорганизмов (см. главу 6). Из почвы микробы поступают в воду и обсеменяют воздух.

Микробиологическое исследование почвы имеет важное значение. Оно проводится при выборе участка для строительства детских учреждений, спортивных площадок, больниц, госпиталей, военных лагерей, водопроводных сооружений и других объектов.

Санитарно-микробиологический анализ почвы включает определение:

1) общего количества бактерий в 1 г почвы;

2) титра санитарно-показательных микроорганизмов БГКП и С. perfringens;

3) термофильных бактерий в 1 г почвы;

4) по эпидемиологическим показаниям проводится исследование на наличие патогенных микроорганизмов (сальмонелл, шигелл, клостридий столбняка, ботулизма, некоторых вирусов и др.).

Отбор проб почвы. Выбор места для отбора проб почвы определяется санитарным врачом и бактериологом в зависимости от цели и задачи исследования. На обследуемой территории до 1000 м 2 выделяют два участка площадью 25 м 2 . Один должен быть расположен близ источников загрязнения (свалки, мусорные ящики, выгребные ямы и т. д.), другой — в отдалении от них (контроль). На каждом участке в 25 м 2 намечают для отбора проб пять точек: четыре по углам и одна в центре или пять точек по диагонали участка.

Для исследования поверхностного слоя почвы пробы отбирают стерильной лопаткой или совком на глубине до 20 см. Из отдельных точек участка лопаткой выкапывают цельный кусок почвы. Стерильным ножом снимают верхний слой толщиной 1,5-2,0 см и из середины куска набирают стерильной ложкой 200-300 г почвы. Смешанный образец, составленный из пяти отдельно взятых проб почвы, должен весить не менее 1 кг.

При исследовании образцов из глубинных слоев почвы (от 0,75 до 2 м) пользуются специальным буром с полостью. На заданной глубине полость бура открывается, наполняется почвой, затем механически закрывается, и бур извлекают на поверхность.

Пробы почвы, взятые для анализа, переносят в стерильные банки с ватно-марлевыми пробками и покрывают стерильной пергаментной бумагой. К каждой банке приклеивают этикетку с указанием даты и номера пробы. В сопроводительном документе отмечают характер почвы, расположение источников загрязнения, площадь обследуемой территории, данные, характеризующие климат местности и т. п.

Все пробы помещают в деревянный ящик с гнездами и немедленно транспортируют в лабораторию. Если нет возможности приступить к исследованию почвы в тот же день, то допускается хранение проб в холодильнике при 1-2° С в течение суток.

Подготовка проб почвы к исследованию. Образцы почвы, отобранные на одном участке из нескольких точек, хорошо перемешивают, освобождают от крупных включений (щебня, камней, корней, стекол). От среднего образца отделяют 200-300 г и вносят в стерильную посуду. Затем почву дробят в стерильной ступке, просеивают через стерильное сито на стерильную бумагу и берут для исследования навеску в 30 г. Навеску почвы высыпают в стерильную колбу вместимостью 500 мл и доливают 270 мл стерильной водопроводной воды, получают разведение почвы 1:10. Взбалтывают почвенную взвесь 10-15 мин и из приготовленного разведения 1:10 без отстаивания готовят ряд последовательных десятикратных разведений по общепринятой методике. При анализе чистых почв ограничиваются 3-4 разведениями (до 1:1000, 1:10000), при исследовании загрязненных почв используют разведения — до 1:100000, 1:1000000.

Определение общего количества бактерий в почве проводят аналогично исследованию воды. Показатели общего количества бактерий для различных видов почв представлены в табл. 55.

Определение БГКП как показателя фекального загрязнения проводят двумя методами: титрационным и методом мембранных фильтров.

Из первоначального разведения почвенной взвеси 1:10 стерильной пипеткой берут 10 мл, что соответствует 1 г почвы, и засевают во флаконы с 50 мл среды Кесслер. Затем из каждого разведения почвы засевают по 1 мл в пробирки с поплавками, содержащими 9 мл той же среды. Посевы выращивают в термостате 24 ч при 37° С.

Просматривают посевы (при задержке роста посевы оставляют на третьи сутки). Отсутствие газообразования и помутнения в бродильных сосудах со средой Кесслер через 48 ч позволяет дать отрицательный ответ.

При наличии в средах газообразования и помутнения или только помутнения из этих сосудов производят высев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Просматривают посевы. Отсутствие роста на среде Эндо дает право на отрицательный ответ.

Если на среде Эндо вырастают типичные для кишечной палочки колонии, то из них делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба на оксидазу отрицательная, то проверяют ферментативные свойства выделенной культуры путем посева на полужидкую среду с глюкозой. Посевы помещают в термостат на 24 ч при 37° С.

Просматривают посевы. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие кишечной палочки в исследуемом разведении почвы.

Коли-титр почвы определяют по наименьшему объему, в котором обнаруживают БГКП (показатели коли-титра для различных видов почв представлены в табл. 55).

Таблица 55. Схема оценки санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям

Метод мембранных фильтров применяют при исследовании малозагрязненных почв. Через стерильные мембранные фильтры № 3 пропускают по 10 мл почвенной взвеси из разведений 1:10, 1:100, 1:1000. Дальнейший ход исследования аналогичен определению кишечных палочек в воде. Метод мембранных фильтров позволяет сократить срок исследования до двух суток. Результаты анализа выражают коли-индексом. Коли-индекс почвы — это количество кишечных палочек в 1 г почвы.

Примечание. Среда Кесслер содержит лактозу, которую сбраживают БГКП, и генциановый фиолетовый, задерживающий рост грамположительной микрофлоры.

Из всех приготовленных почвенных разведений (от 1:10 до 1:1000000) по 1 мл вносят в два параллельных ряда стерильных пробирок. Один ряд пробирок прогревают при 80° С 15 мин для освобождения от неспороносной микрофлоры. Затем во все пробирки наливают по 9 мл расплавленной и остуженной до 45° С среды Вильсона — Блера, приготовленной ex tempore. Пробирки вращают между ладонями, чтобы посевной материал равномерно распределился в питательной среде, и быстро опускают их в холодную воду для удаления кислорода и охлаждения среды. Посевы выращивают при 43° С 24 ч.

C. perfringens дает рост в глубине среды в виде черных колоний. Газообразование регистрируется по разрыву питательной среды. В мазках, приготовленных из колоний, обнаруживают грамположительные крупные палочки со спорами овальной формы, расположенные центрально или субтерминально.

Предельное разведение почвенной взвеси, которое дает на среде Вильсона — Блера рост C. perfringens, означает титр этого микроба в почве (см. табл. 55). Наличие в почве C. perfringens является косвенным показателем присутствия в ней и других клостридий — возбудителя столбняка (C. tetani), возбудителя ботулизма (C. botulinum).

В почве определяют также количество термофильных бактерий в 1 г. Почва, в которой много кишечных палочек и мало термофилов, может рассматриваться как загрязненная фекалиями.

Среда Кесслер. К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят 20-30 мин, фильтруют через вату, прибавляют 10 г лактозы и доводят объем до 1 л. Устанавливают рН 7,4-7,6. Добавляют 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового. Среду разливают в колбы и пробирки с поплавками. Стерилизуют 15 мин при давлении 0,5 атм (112° С). Среда имеет фиолетовый цвет.

Контрольные вопросы

1. В каких случаях проводят санитарно-бактериологическое исследование почвы?

2. Какие определения включают санитарно-бактериологический анализ почвы?

3. Как проводят отбор проб почвы?

4. Какими методами определяют наличие БГКП в почве?

Задания

1. Приготовьте из почвенной взвеси в разведении 1:10 ряд последовательных разведений 1:100, 1:1000,1:10000 и проведите определение микробного числа в данной пробе почвы.

2. Возьмите у преподавателя готовые посевы разведений почвы на среде Вильсона — Блера, определите титр C. perfringens. Сделайте мазки из колоний, окрасьте по Граму. Найдите под микроскопом в мазках C. perfringens и покажите преподавателю. Результаты микроскопии зарисуйте в тетрадь.

Источник

Бактериологическое исследование почвы проводят

Важную роль в изучении почвенной микрофлоры играет экологический метод.

При изучении почвенной микрофлоры и вызываемых ею микробиологических процессов, прежде всего, изучаются сообщества микроорганизмов, участвующие в разложении растительных остатков (грибы, маслянокислые и аммонифицирующие бактерии) и минерализации (нитрифицирующие, аэробные целлюлозоразлагающие и др.).

При исследовании микрофлоры почвенных горизонтов необходимо делать разрез почвы.

При взятии проб снимают верхний слой почвы на глубину 0,5 – 1,0 см и очищают наружный слой вертикальной стенки почвенного разреза.

Пробы почвы по слоям и горизонтам необходимо брать чистым и стерильным инструментом.

При изучении микрофлоры почвы проводится количественное определение физиологических групп микроорганизмов.

Санитарными показателями почвы являются: общее микробное число, коли – титр и перфрингенс – титр.

Счет бактерий в грунте проводится двумя методами: методом разливок и прямым методом в той или иной модификации.

При определении содержания бактерий методом разливок необходимо сделать разведение почвенной суспензии, поскольку почва богата бактериями.

Для приготовления разведений необходимо иметь стерильную посуду (колбы, пробирки, пипетки) и стерильную воду или физиологический раствор.

В стерильную колбу, содержащую 100 мл стерильной воды, помещается стерильно отвешенный 1 г почвы и содержимое колбы тщательно взбалтывается.

Из полученной суспензии в пробирках со стерильной водой готовятся разведения почвы 1/100. 1/1000. 1/10 000 г.

Для этого 1 мл основной суспензии стерильно вносится в пробирку с 9 мл стерильной воды, а затем методом переката (из предыдущей пробирки в последующую с 9 мл стерильной воды) готовятся последующие разведения почвы.

После приготовления разведений делаются посевы из основной суспензии и приготовленных разведений в чашки Петри. В чашки Петри к исследуемой суспензии добавляется расплавленный и охлажденный до 42 градусов мясо – пептонный агар (МПА). Содержимое чашек Петри тщательно аккуратно перемешивается (так, чтобы агар не выливался за бортики чашки). Чашки выдерживаются на ровной поверхности до полного остывания агара. Затем все чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат.

Чашки необходимо переворачивать вверх дном для того, чтобы капля образующейся на крышке конденсационной воды не капнула на агар и не обусловила слияние выросших на агаре колоний микроорганизмов.

Слияние колоний не позволит сделать правильно количественный учет особей микробов в исследуемом объеме почвы.

Подсчет выросших колоний производится через 48 часов и через 10 суток. Из всех посевов высчитывают среднее арифметическое число на 1 г влажной и сухой почвы.

Для прямого подсчета бактерий в почве применяют различные способы, в основу которых положен метод прямого счета, разработанный С.Н.Виноградским.

По способу А.С.Разумова 1 г почвы добавляют к 500 мл стерильной водопроводной воды и встряхивают в течение 10 минут.

Полученной суспензии дают отстоятся 2 – 3 секунды и стерильной пипеткой отбирают 4 мл, которые фильтруют через мембранный фильтр.

Фильтр стерильно переносится и наносится на питательную среду в чашке Петри.

После экспозиции в термостате производится подсчет выросших колоний и делается перерасчет на 1 г почвы.

Для выявления микроорганизмов различных физиологических групп и их количественного учета пользуются методом предельных разведений.

С этой целью готовят взвесь почвы в воде (10 г почвы добавляют к 90 мл стерильной воды) и тщательно взбалтывают в течение 5 минут.

Из полученной маточной суспензии готовят разведения и производят посев на соответствующие плотные и жидкие питательные среды.

Для выявления аммонифицирующих бактерий используется пептонная вода.

Признаками развития аммонифицирующих бактерий являются помутнение питательной среды, образование пленки и осадка, положительная реакция на аммиак с реактивом Несслера.

Общее количество маслянокислых бактерий определяют путем посева на картофельную среду. Основным показателем присутствия маслянокислых бактерий является газообразование, пигментация и мацерация картофеля.

Для выявления нитрифицирующих бактерий разведения почвенной суспензии высевают на среду, содержащую аммонийно-магниевую соль фосфорной кислоты. О наличии нитрифицирующих бактерий судят по реакции на азотистую и азотную кислоты и образованию прозрачных зон на поверхности соли.

Для выявления спорообразующих анаэробов, основная почвенная суспензия предварительно прогревается при 80 градусах в течение 20 минут, после чего разведения суспензии высеваются на питательные среды. Посевы выдерживаются в термостате в анаэробных условиях.

При определении перфрингенс – титра разведения почвенной суспензии высеваются в пробирки со средой Вильсон – Блера.

Количество грибов из родов аспергиллюс и пенициллиум определяется путем посева разведений исследуемой почвенной суспензии на сусло – агар.

Источник

Санитарно-бактериологическое исследование почвы

При исследовании почвы может проводиться полный или краткий анализ.

Полный санитарно-бактериологический анализ почвы проводится:

а) для подробной и глубокой характеристики санитарного состояния почвы;

б) для определения пригодности почвы при размещении жилья, мест отдыха, детских учреждений и водопроводных сооружений;

в) для эпидемиологических исследований.

Краткий анализ рекомендуется при осуществлении текущего санитарного надзора и включает определение общего количества сапрофитных бактерий, БГКП (коли-титр и коли-индекс), клостридий (перфрингенс-титр), термофильных бактерий, нитрифицирующих.

В полный санитарно-бактериологический анализ входят дополнительно: определение актиномицетов, грибов, сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, бруцеллеза, сибирской язвы.

Почву освобождают от включений – камней, осколков стекла и др. Крупные агрегаты почвы дробят. Навеску почвы в количестве 30 г заливают стерильной водопроводной водой в соотношении 1:10. Полученную суспензию встряхивают 10 мин и отстаивают 2-5 мин. Из первого разведения 1:10 готовят ряд последующих 10-ти кратных разведений от 1:10 до 1:1000 при исследовании чистых почв и до 1:10 000 при исследовании сильно загрязненных почв.

Определение общего количества сапрофитных бактерий

(микробное число почвы)

Микробное число почвы – общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы.

Посев почвенной суспензии производят на МПА в чашки Петри по 1 мл из каждого разведения. Затем в чашки выливают по 7-10 мл расплавленного и остуженного до 45 0 С агара. Посевы инкубируют при 28-30 0 С в течение 72 ч и подсчитывают количество выросших колоний. Если на чашке Петри вырастает более 150 колоний, то подсчет ведется на ¼ площади с последующим перерасчетом на всю площадь. Из суммы колоний, подсчитанных на всех чашках Петри, выводится среднее арифметическое и затем определяют количество микроорганизмов в 1 г почвы с учетом разведений.

Определение бактерий группы кишечной палочки

Коли-индекс – количество жизнеспособных E. coli в 1 г почвы.

При анализе малозагрязненных почв используют метод мембранных фильтров. При предполагаемой невысокой степени фекального загрязнения рекомендуется применение титрационного метода. При высокой степени фекального загрязнения рекомендуется метод прямого посева почвенной суспензии (1:10) на среду Эндо.

Метод мембранных фильтров. Почвенную суспензию 1:10 центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, затем 5-10 мл суспензии фильтруют через мембранные фильтры №3 в аппарате Зейтца. После фильтрования верхнюю часть прибора снимают и фильтр осторожно стерильным пинцетом переносят на среду Эндо в чашку Петри. Фильтр накладывают вверх поверхностью, на которой осели бактерии. Чашки Петри инкубируют при 37 0 С 24 ч. При наличии в почве БГКП на фильтрах появляются колонии типичные для кишечных палочек – темно-красные с металлическим блеском или розовые с красным центром. Из таких колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Для отличия бактерий семейства Enterobacteriaceae от Pseudomonadaceae ставят оксидазный тест. Для этого на культуру микроорганизмов в чашке Петри наносят индикатор – 1% раствор диметилпарафенилендинитролазы. В положительном случае через 15-20 мин появляется темно-синее окрашивание. Колонии учитывают как БГКП, если они образованы грамотрицательными палочками, ферментирующими глюкозу до кислоты и газа и не обладающие протеолитической активностью.

Колонии подсчитывают на тех фильтрах, на которых из соответствующего разведения почвенной суспензии выросло не более 30-50 колоний.

Пересчитывают количество выросших колоний на фильтрах на 1 г почвы и определяют коли-индекс.

Коли-титр почвы – наименьшее количество почвы, в котором обнаруживается жизнеспособная E. coli.

Титрационный метод. Из приготовленных разведений почвенной суспензии делают посевы в питательную среду Кесслера (1% пептона, 5% желчи, 0,25% лактозы, генциановый фиолетовый). Из разведений 1:10 10 мл засевают во флакон с 50 мл среды, что соответствует 1 г почвы. Посев меньших количеств (0,1 и 0,01) делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9 мл среды. Отсутствие во всех пробирках роста и газообразования указывает на отсутствие БГКП. Если в посевах обнаруживается рост или рост и газообразование, делают высев в чашки Петри со средой Эндо или в пробирки с розоловым агаром, инкубируют 24 ч при 37 0 С и проводят дальнейшую идентификацию выделенных бактерий. Результат выражают в коли-титре.

Перфрингенс-титр почвы – наименьшее весовое количество почвы, выраженное в граммах, в котором обнаруживается жизнеспособная клетка C. perfringens.

Определение перфрингенс-титра является важным критерием для санитарной оценки почвы и ее самоочищения, так как в почве, загрязненной фекалиями, уже через 4-5 мес эшерихии исчезают, а C. perfringens обнаруживаются в титре 0,01. Перфрингенс-титр дает возможность судить о давности фекального загрязнения.

Из приготовленных разведений почвенной суспензии по 1 мл переносят в два параллельных ряда пробирок. Один ряд прогревают при 80 0 С 15 мин. Затем во все пробирки наливают по 9-10 мл расплавленной и охлажденной до 45 0 среды Вильсона-Блер. Инкубацию посевов проводят при 43 0 24 ч, но уже через 2-3 ч при положительном результате можно наблюдать в толще агара образование круглых колоний черного цвета. В мазках приготовленных из колоний видны характерные грамположительные палочки.

Определение термофильных бактерий

Учет термофильных бактерий производят на МПА, разлитом в чашки Петри более толстым слоем, чем обычно. Посев делают из разведений 1:10, 1:100, 1:1000, причем из каждого разведения рекомендуется засевать по 2-3 параллельные чашки. Термофильные бактерии выращивают при температуре около 60 0 . Результат учитывают через 24 ч после посева. Подсчет количества бактерий проводят на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическая оценка почвы

Ее производят по комплексу показателей. Для санитарной оценки почвы необходимо пользоваться показателями таблицы 2.

Схема санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям

Микрофлора воды

Вода является естественной средой обитания разнообразных микроорганизмов.

Микрофлора воды делится на две группы: автохтонную и аллохтонную.

Автохтонная или собственная микрофлора представлена микроорганизмами, постоянно живущими и размножающимися в воде. В состав этой группы входят Micrococcus candicans, Sarcina lutea, Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus и др.

Аллохтонная или заносная микрофлора попадает в открытые водоемы из почвы, воздуха, организмов животных и человека и резко изменяет микробный биоценоз и санитарный режим.

Количественный и качественный состав микрофлоры воды зависит от состава и концентрации минеральных и органических веществ, температуры, рН, скорости движения воды, массивности поступления ливневых, фекально-бытовых и промышленных сточных вод. Количество микробов прямо пропорционально степени загрязненности водоемов. Особенно богаты микроорганизмами пруды, ручьи, озера густо населенных районов. В закрытых водоемах (озера, пруды) наблюдается определенная закономерность в распределении бактерий. Состав микроорганизмов различен на поверхности воды и на дне водоемов. Наиболее обильно заселена микроорганизмами вода на глубине 10-100 см. В более глубоких слоях их количество значительно снижается.

Ключевые воды и воды артезианских колодцев наиболее чисты.

Хотя вода и является неблагоприятной средой для существования условнопатогенных и патогенных микроорганизмов, отдельные их представители способны существовать в ней определенное время, а в некоторых случаях и размножаться. Многие годы в воде могут сохраняться споры возбудителя сибирской язвы, несколько месяцев – энтеровирусы, сальмонеллы, лептоспиры, несколько недель – возбудители холеры, дизентерии, бруцеллы.

Источник