Проточный биореактор
Применение: изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования клеток и тканей растительного и животного происхождения, а также для изучения влияния различных факторов внешней среды на культивирование объектов при проведении биологических опытов. Сущность изобретения: проточный биореактор содержит сосуд для питательной среды, закрытый герметичной крышкой и соединенный с сосудом для выращивания гибкой трубкой, причем сосуд для питательной среды и соединение выполнены с возможностью вытеснения питательной среды из сосуда нагреванием находящегося в нем воздуха. Биореактор может дополнительно содержать сосуд для отработанного питательной среды, соединенный с сосудом для выращивания трубкой из гибкого материала. 4 з.п. ф-лы, 1 ил.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования клеток и тканей растительного и животного происхождения, а также для изучения влияния различных факторов внешней среды на культивируемые объекты при проведении биологических исследований.
Известно широко применяемое в практике биологических исследований устройство, представляющее собой плоскую чашку (чашка Петри), вмещающую жидкую или отвержденную (агаризованную) питательную среду и закрытую чаще всего негерметично прилегающей к стенкам чашки крышкой [1] Основным недостатком такого устройства является низкая защищенность выращиваемых объектов от внешнего заражения и необходимость частой пересадки (через 1-3 недели) этих объектов на свежую среду для устранения их самоотравления продуктами своей жизнедеятельности, что связано еще каждый раз с повышенным риском внесения внешнего заражения.
Известно также устройство для культивирования клеток с циркуляционным движением питательного раствора в нем (циркуляционный биореактор), состоящий из сосудов для питательной среды и выращивания клеток, двух трубок, каждая из которых соединяет дно одного сосуда с верхом другого, и перистальтического насоса (см. Биотехнология сельскохозяйственных растений /пер. с англ. М: Агропромиздат, 1987, с. 50-55).
Последнее устройство принимается за прототип в связи с наибольшей близостью по своей технической сущности к заявляемому. Недостатком прототипа является также, хотя и в меньшей степени, чем в аналоге, низкая защищенность выращиваемых объектов от внешнего заражения и возможность самоотравления продуктами своей жизнедеятельности, накапливающимся в циркулирующей питательной среде.
Задачей изобретения является создание простого и надежного в работе устройства с повышенной степенью защищенности от внешнего биологического заражения и удалением вредных продуктов жизнедеятельности из сосуда для культивирования биологических объектов.
Эта задача решается в устройстве, состоящем из сосуда для питательного раствора, сосуда для выращивания биологических объектов, соединительной трубки между ними, причем, согласно изобретению, сосуд для питательного раствора оборудован сплошной герметически закрывающей его крышкой, соединительная трубка выполнена из гибкого материала, устройство также снабжено сосудом для отработанного раствора при герметичном соединении его с сосудом для выращивания биологических объектов и использование для соединения этих сосудов трубки из гибкого материала.
Из приведенной сущности устройства видно, что одним из основных его отличиев является оборудование сосуда для питательного раствора сплошной герметически закрывающей его крышкой. Наличие этого конструктивного элемента позволяет исключить микробиологическое заражение питательного раствора в процессе эксплуатации устройства. При этом оказывается невозможным заражение сосуда для выращивания биологических объектов от питательного раствора. В случае же появления заражения в сосуде для культивирования питательная среда остается стерильной в своем сосуде, так как этот раствор отделен от сосуда культивирования воздушным пространством.
Другим отличием является выполнение соединительной трубки между сосудами для питательного раствора и культивирования из гибкого материала. Такое техническое решение позволяет устанавливать сосуд с питательным раствором на разной высоте относительно сосуда для выращивания биологических объектов, что дает дополнительные гарантии против неконтролируемого излива питательной среды в сосуд для выращивания (например в случае резких суточных колебаний температуры в рабочем помещении).
Еще одним отличием устройства является то, что оно снабжено сосудом для отработанного раствора, герметично соединенным с сосудом для выращивания биологических объектов. Введение такого конструктивного элемента обеспечивает защиту биологических объектов от микробиологического заражения со стороны отработанного раствора. Кроме того, наличие этого сосуда позволяет накапливать и сохранять в стерильных условиях продукты жизнедеятельности культивируемых объектов.
И, наконец, последним отличием является использование для соединения сосудов для культивирования и отработанного раствора трубки из гибкого материала. Такое конструктивное решение позволяет устанавливать сосуд для отработанного раствора на различных высотах относительно сосуда для культивирования. Это обеспечивает поддержание уровня и соответствующего ему необходимого объекта питательного раствора в сосуде для культивирования на уровне точки излива из соединительной трубки в сосуде с отработанным раствором.
Кроме того, устройство обладает рядом других положительных свойств, к которым в первую очередь следует отнести: возможность регулирования газовой среды в сосуде для культивирования; возможность замены состава питательного раствора в процессе культивирования объекта без перемещения его в другой сосуд и связанных с этим опасности заражения и механического повреждения объекта; простота подачи и выпуска растворов в сосуд для культивирования без использования для этого механических устройств (водяных, воздушных насосов) и др.
Заявляемое устройство иллюстрируется чертежом, на котором видно: кран 1 для выпуска отработанного раствора; отработанный раствор 2; сосуд 3 для отработанного раствора; газообменная трубка 4 с фильтром на сосуде для отработанного раствора; подложка 5; сосуд 6 для выращивания биологических объектов; газообменная трубка 7 с фильтром на сосуде для выращивания биологических объектов; питательный раствор 8; сосуд 9 для питательного раствора; крышка 10; соединительная трубка 11; соединительная трубка 12.
Работа устройства поясняется следующим примером. По данному примеру в устройстве применен кран 1 зажимного типа; для сосуда 3 использована стеклянная емкость объемом 100 мл и имеющая герметично закрывающую ее крышку с отверстиями для газообменной и соединительной трубкой; газообменная трубка 4 выполнена из стекла и частично заполнена ватой в качестве фильтра; в качестве подложки 5 использован песок; для сосуда 6 использована стеклянная емкость объемом 100 мл, имеющая также герметично закрывающую ее крышку, которая также герметично соединена с газообменной и соединительной трубками; газообменная трубка 7 аналогична трубке 4; для сосуда 9 использована узкогорлая стеклянная емкость объемом 300 мл; в качестве крышки 10 использована сплошная резиновая пробка; соединительная трубка 11 имеет диаметр 5 мм и дину 150 мм и выполнена из резины; соединительная трубка 12 имеет диаметр 10 мм и длину 30 мм.
Работа с устройством начинается со стерилизации основных его частей и посадки культивируемого объекта на подложку. Стерилизация и посадка производятся по общепринятым методикам.
После посадки соединяют сосуды между собой в стерильных условиях (в ламинарбоксе) в одно целое так, как показано на фиг.1. При этом сосуд для культивирования находится непосредственно над сосудом для отработанного раствора, а сосуд для питательного раствора расположен ниже сосуда для культивирования.
Для подачи питательного раствора в сосуд 6 производят нагрев воздуха в сосуде 9, в результате чего воздух расширяется и вытесняет питательный раствор в сосуд 6. После подачи необходимого количества раствора нагрев прекращен, в результате чего воздух в сосуде 9 охлаждается, сжимается и засасывает соответствующую часть воздуха из сосуда 6.
Нагрев воздуха можно производить специальными нагревателями, располагаемыми вблизи верхней части сосуда 9 или внутри его. При малых размерах устройства, как по данному примеру, нагрев можно производить прикосновением руки к верхней части сосуда.
Слив отработанного раствора происходит самотеком через подложку 5 и соединительную трубку 12. Поскольку по данному примеру точка излива находится ниже дна сосуда 6, то свободного объема питательного раствора в этом сосуде не образуется. Необходимое же количество питательного раствора для жизнедеятельности культивируемого объекта находится в подложке и удерживается в ней капиллярными силами.
При периодической подаче раствора из сосуда 9 происходит замена отработанного раствора в подложке на свежий. Тем самым осуществляется проточный режим движения раствора в устройстве, достигается удаление вредных продуктов жизнедеятельности культивируемого объекта и поддержание оптимальных условий для его развития.
При необходимости изменения газовой среды в сосуде 6 подают газ требуемого состава в этот сосуд через газообменную трубку 7. Этот газ поступает в сосуд 6, вытесняет из него находящийся там воздух через соединительную трубку 12 в сосуд 3, из которого избыток воздуха выделяется через газообменную трубку 4.
1. Проточный биореактор, состоящий из сосуда для питательного раствора, сосуда для выращивания биологических объектов, соединительной трубки между ними, отличающийся тем, что сосуд для питательного раствора оборудован сплошной герметически закрывающей его крышкой, при этом сосуд для питательного раствора и соединение его с сосудом для выращивания выполнены с возможностью вытеснения питательного раствора из содержащего его сосуда нагреванием находящегося в нем воздуха.
2. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что соединительная трубка между сосудами выполнена из гибкого материала.
3. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что он снабжен сосудом для отработанного раствора, герметично соединенным с сосудом для выращивания биологических объектов.
4. Биореактор по п.3, отличающийся тем, что для соединения сосуда для выращивания биологических объектов с сосудом для отработанного раствора использована трубка из гибкого материала.
5. Биореактор по п.1, отличающийся тем, что в качестве нагревателя использована рука пользователя биореактора, прикладываемая для этого к верхней части сосуда с питательным раствором.
Источник
Кровеносные сосуды XXI века
Тканеинженерная матрица для выращивания кровеносного сосуда
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Начало XXI века сопровождается активным развитием тканевой инженерии — дисциплины, объединившей в себе медицину и биотехнологию. Главной задачей этого направления стало создание живых органов для пациентов, нуждающихся в их пересадке. В последнее десятилетие появилось множество работ, свидетельствующих о значительных успехах в этой области. На основе накопленных знаний нами был разработан совершенно новый тканеинженерный сосуд, способный заменить поврежденные артерии. Проведенные эксперименты показали, что с его помощью возможно вырастить кровеносный сосуд непосредственно в живом организме.
Конкурс «био/мол/текст»-2013
Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Своя работа».
Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.
Искусственное создание живых тканей, органов и даже целых организмов на протяжении всей истории человечества было предметом мифов, легенд и фантастических историй, и не давало покоя человеческому воображению. Идея создания органов и организмов из одного маленького кусочка живой ткани уходит своими корнями в глубокую древность. В культурной истории человечества как в зеркале отражается развитие взглядов на выращивание органов [1]. Примерами самого раннего возникновения этих идей можно считать древнегреческие мифы о Прометее, а также сотворение Евы из ребра Адама в библейских историях (рис. 1).
Рисунок 1. Сотворение Евы. Фреска Микеланжело Буонарроти (1508–1512).
В процессе того, как расширялись знания людей в понимании природы, возникали все новые научные подходы. Об этом свидетельствует убежденность ученых того времени, что живое существо можно создать с помощью алхимии, отраженная в работах Парацельса. Яркие примеры в искусстве и литературе демонстрируют желание человека самостоятельно создавать жизнь, используя возможности, которые были присущи той или иной эпохе; среди них «Лечение Юстиниана» Фра Анджелико (1439), «Фауст» Иоганна Гете (1774–1831), «Франкенштейн» Мэри Шелли (1818) и многие другие. Параллельно с развитием этих идей в культуре активно шли научно-практические работы по созданию и восстановлению частей человеческого тела. Предпосылками возникновения тканевой инженерии как науки было использование различных материалов для механической замены утерянного органа: различные имплантаты зубов из слоновой кости и металла, деревянные протезы ног и т.д. Но только прорывное открытие Росса Гаррисона (1870–1959), а именно культивирование клеток (то есть, их выращивание в лабораторных условиях) стало основой того, что можно считать классической тканевой инженерией [2].
То, что в одном веке считают мистикой, в другом становится научным знанием.
Парацельс
В настоящее время тканевая инженерия работает над воплощением идей создания органов и их использования в клинической медицине. Тканевая инженерия не только претворяет в жизнь давние мечты и фантазии человечества, но также решает сложные задачи, связанные с заменой поврежденных органов у пациентов [3]. Хорошо известно, что большое число пациентов по всему миру нуждаются в срочной пересадке органов: сердца, легких, печени, почек и т.д., и не всегда дожидаются своей очереди. Кроме того, после пересадки донорского органа остаются проблемы, связанные с отторжением трансплантата. В свою очередь, тканевая инженерия позволяет создавать необходимые органы из клеток самого пациента, предотвращая тем самым негативную реакцию организма на чужеродный орган. Мочевой пузырь, выращенный из собственных клеток пациента, был первым тканеинженерным органом, который трансплантировали человеку. Эта работа была проведена ведущим специалистом в области тканевой инженерии Энтони Аталой (Anthony Atala) и его коллегами в 2006 году [4]. На сегодняшний день с помощью тканевой инженерии ученые создают кожу, кости, хрящи, поджелудочную железу, элементы сердечно-сосудистой системы и т.д. Также большой интерес представляет разработка тканеинженерных кровеносных сосудов, так как они крайне необходимы для проведения операций при заболеваниях, в результате которых у пациента нарушена проходимость сосудов для крови, и при этом невозможно использовать синтетические протезы [5].
Подробнее о принципах и успехах тканевой инженерии можно прочесть в статье «Тканевая инженерия — окно в современную медицину» [6]. — Ред.
Как для создания всех других органов, так и для изготовления тканеинженерного кровеносного сосуда необходимо три основных компонента. Первым и самым важным компонентом являются стволовые клетки, которые представляют собой основной строительный материал для формирования нужного органа. Клетки берут из костного мозга, крови или других тканей пациента и затем культивируют в специальных лабораторных условиях для увеличения их количества. Ткань, из которой получают клеточный материал для культивирования, выбирают в зависимости от того, какие клетки нужны для выращивания данного органа. Для кровеносного сосуда необходимо как минимум два типа клеток: гладкомышечные клетки, которые формируют стенку, и эндотелиальные клетки, которые выстилают внутреннюю поверхность кровеносного сосуда и предохраняют его от образования тромбов. В культуре клетки располагаются одним слоем, но в нашем организме они находятся в трехмерном пространстве, поэтому их необходимо каким-то образом организовать и придать им нужную ориентацию. Для этого в тканевой инженерии существует еще два компонента: матрица и биореактор.
Так называемая тканеинженерная матрица представляет собой каркас будущего органа и имеет пористую структуру. Поры необходимы для того, чтобы в них, как в нишах, располагались клетки. Форма матрицы соответствует форме органа, который необходимо вырастить. В случае с кровеносным сосудом матрица имеет форму трубки с пористыми стенками. Для создания тканеинженерной матрицы необходимо использовать абсолютно безопасный материал, который не вызывает каких-либо аллергических и иммунных реакций. Также для создания некоторых органов, а в особенности кровеносных сосудов, требуются матрицы, обладающие большой прочностью и эластичностью, чтобы выдержать давление, создаваемое током крови. В качестве материала чаще всего используют различные полимеры. К ним относятся природные материалы, такие как коллаген, хитозан, гиалуроновая кислота, а также синтетические полимеры. Матрицы из таких материалов постепенно разрушаются в организме (биодеградируют) и замещаются новыми тканями организма.
Для того чтобы посадить имеющиеся клеточные культуры на матрицу и помочь им образовать новую трехмерную ткань, инженеры сконструировали различные виды биореакторов. Кровеносные сосуды выращивают в пульсирующем биореакторе, который создает поток культуральной жидкости, тем самым имитируя ток крови в кровеносном русле (рис. 2). При этом механические воздействия, которым подвергаются клетки, оказывают благоприятное влияние на рост ткани. Таким образом, в биореакторе вырастает живой кровеносный сосуд, который затем имплантируют пациенту [7].
Рисунок 2. Биореактор для выращивания сосудов
Однако для того, чтобы вырастить орган, необходимо значительное время. Работая над проблемой создания протеза кровеносного сосуда, мы столкнулись с вопросом: что же делать в том случае, если пациент нуждается в срочном проведении операции, например аортокоронарном шунтировании, и не может ждать, пока его кровеносный сосуд вырастет? Чтобы ответить на этот вопрос и найти решение данной проблемы, мы обратились к одному из подходов тканевой инженерии, а именно выращиванию органов в организме пациента. Как же это возможно? Для этого матрица помещается в тот орган, часть которого необходимо восстановить. Таким образом, человеческий организм сам играет роль биореактора, и орган растет на матрице в благоприятной для него среде. Данный подход также предполагает использование матриц из биодеградируемого, то есть разрушаемого материала. Это необходимо для того, чтобы к моменту окончательного формирования органа материал матрицы полностью удалился из организма. Формирование органа, таким образом, возможно благодаря тому, что стволовые клетки организма способны мигрировать в зоны повреждения, где они активно делятся и осуществляют восстановление тканей.
И создал Господь Бог человека из праха земного.
Ветхий завет, Книга Бытия
Основываясь на данном подходе, нами был разработан сосудистый тканеинженерный графт, который имплантируется в ту область кровеносного русла, которая требует восстановления. В своей работе мы использовали синтетический полимер — поликапролактон. Поскольку известно, что синтетические полимеры более прочны по сравнению с природными, их чаще используют для изготовления тканеинженерных матриц. Поликапролактон известен высокой прочностью и эластичностью, а также тем, что его разрушение в организме происходит в течение длительного времени (более одного года) [8]. Считается, что этого времени должно быть достаточно для того, чтобы сформировался новый полноценный кровеносный сосуд.
Мы изготовили матрицы кровеносных сосудов из поликапролактона диаметром 2 мм (см. заглавный рисунок) с помощью метода электроспиннинга. Элетроспиннинг не имеет ничего общего с электрической удочкой и рыбалкой, а представляет собой метод создания очень тонких волокон из раствора полимера под действием электростатичесих сил. Материалы, получаемые данным методом, состоят из волокон, которые имеют микро- и наноразмеры [9].
Изготовленные матрицы состоят из волокон диаметром около 3 мкм, которые переплетаются между собой и образуют тем самым огромное количество пор (рис. 3). Такая структура материала очень нравится стволовым клеткам, которые способны проникать в стенку пористой матрицы и располагаться в порах как в нишах. Проникая в структуру матрицы, клетки активно делятся, растут и вырабатывают внеклеточное вещество, состоящее из коллагеновых и других волокон, которое впоследствии замещает полимерный материал [10].
Рисунок 3. Сканирующая электронная микроскопия матрицы из поликапролактона, изготовленной методом электроспиннинга
Проведя оценку механических свойств наших сосудистых матриц, мы смогли убедиться в том, что они не уступают по прочности и эластичности уже существующим синтетическим и биологическим протезам, которые используются в настоящее время в сердечно-сосудистой хирургии. А это значит, что после имплантации в кровеносное русло они смогут выдержать нагрузку, создаваемую током крови, и будут прекрасно выполнять свою функцию.
Так как сосудистые матрицы взаимодействуют непосредственно с кровью, очень важно, чтобы материал, из которого они изготовлены, не провоцировал образование тромбов. В противном случае образовавшиеся тромбы будут препятствовать току крови, что может привести к трагичным последствиям. В экспериментах с использованием донорской крови мы определили, что разрабатываемая матрица для восстановления кровеносного сосуда не вызывает образование тромбов, а значит, может быть имплантирована в кровеносное русло живого организма.
Однако для более полной оценки свойств сосудистых матриц их имплантировали в кровеносное русло крыс, а именно в брюшную часть аорты (рис. 4). В течение года мы наблюдали с помощью ультразвукового анализа, что имплантированная матрица проходима для крови. После чего матрицы извлекли из животных, и, оценивая их под световым микроскопом, обнаружили, что вся пористая стенка сплошь пронизана клетками, между которыми находится межклеточное вещество. Кроме того, вся внутренняя поверхность матрицы покрыта эндотелиальными клетками. Эти клетки формируют внутреннюю выстилку всех кровеносных сосудов. Все это свидетельствует о формировании на основе полимерной матрицы нового кровеносного сосуда.
Рисунок 4. Крыса линии Wistar после имплантации сосудистой матрицы
Проведенные нами исследования показывают, что в организме крысы такие сосудистые матрицы прекрасно функционируют и остаются проходимы в течение длительного времени (рис. 5). Однако человеческий организм слишком сильно отличается от организма крысы, в связи с чем необходимо проведение дальнейших исследований по усовершенствованию и тестированию матриц для регенерации кровеносных сосудов. Необходимо быть полностью уверенным, что матрицы абсолютно безопасны для здоровья человека. Используемый нами подход к выращиванию кровеносных сосудов направлен на то, чтобы исключить длительные и сложные этапы, связанные с получением клеток у пациента, увеличением их количества, а также культивированием на матрице в биореакторе. Это позволит очень быстро оказать помощь пациенту и значительно снизить затраты на выращивание органа. Стоимость тканеинженерных органов представляет собой одну из проблем тканевой инженерии, поскольку полное создание органа в биореакторе является очень дорогостоящей процедурой. Поэтому для того, чтобы тканеинженерные продукты были доступны для использования в медицинской практике, цена на них должна быть адекватной.
Рисунок 5. Компьютерная томография сосудистой матрицы, имплантированной в аорту крысе, через год после имплантации
В настоящее время в мире активно ведутся работы по выращиванию практически всех тканей и органов человеческого тела. Некоторые из них уже находятся в клиническом использовании, другие — еще на испытаниях и в разработке. Возможно, стремительный прогресс в области создания и восстановления поврежденных органов в скором времени приведет к широкому применению данной технологии в клинической практике и поможет продлить жизнь многим пациентам. А для некоторых больных тканеинженерные органы могут стать последней надеждой.
Исследование проведено при сотрудничестве Лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» СО РАМН, г. Кемерово, Россия (под руководством к.м.н. Алексея Сергеевича Головкина) и Cleveland VA Medical Center, Огайо, Кливленд, США (под руководством д.м.н. Якова Львовича Эльгудина).
Источник