Дегидрогеназная активность почв это

Законодательная база Российской Федерации

Бесплатная горячая линия юридической помощи

Бесплатная консультация

Навигация

Федеральное законодательство

Действия

• Главная
• «МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО — МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ ПОЧВЫ» (утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 19.02.81 N 2293-81) (извлечение)

Определение дегидрогеназной активности микроорганизмов

Определение основано на способности ферментов микроорганизмов — дегидрогеназ восстанавливать за счет дегидрирования субстрата бесцветный трифенилтетразолийхлорид (ТТХ) до формазана (трифенилформазана), имеющего темно — красный цвет. Дегидрогеназы высоко чувствительны к действию биологических ядов, в присутствии которых их активность снижается. Это позволяет путем сравнения количества восстановленного дегидрогеназами микроорганизмов ТТХ в опытах и контроле оценить степень токсичности исследуемого вещества.

Ход определения. Готовят в физиологическом растворе густую суспензию тест — микроорганизмов из суточной культуры на скошенном агаре. Бактериальные клетки осаждают центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 мин. (Экспозиция установлена для кишечных палочек и сибиреязвенных бацилл.) Надосадочную жидкость сливают, а клетки отмывают от посторонних примесей 3 — 4 раза водопроводной водой или физраствором при той же скорости и времени центрифугирования. Из отмытых клеток готовят стандартную суспензию в физрастворе с постоянной плотностью, соответствующей показанию ФЭК 0,32 — 0,34. Плотность суспензии определяют на ФЭКе в кюветах 5 мм, при зеленом светофильтре.

В химически чистые сухие пробирки вносят в указанной последовательности следующие растворы: 1,2 мл 1/15 Na2HPO4, 0,5 мл 0,1 М глюкозы (субстрат для дегидрирования), 0,1 мл 0,1 М MgSO4, 0,2 мл 0,5% трифенилтетразолийхлорида (ТТХ), 1 мл бактериальной суспензии и исследуемое вещество в количестве, создающем необходимую его концентрацию в пересчете на 1 л. Общий объем реакционной смеси должен быть равен 3 мл. Смесь инкубируют в термостате при 37 град. C в течение 2 часов до появления окраски формазана.

Для извлечения формазана клетки разрушают ледяной уксусной кислотой, которую добавляют по 3 мл в каждую пробирку. Из реакционной смеси формазан экстрагируют толуолом (3 мл в каждую пробирку). Для полного извлечения формазана из реакционной смеси пробирки несколько раз встряхивают и отстаивают. На полноту извлечения формазана указывает обесцвечивание реакционной смеси. Формазан очень осторожно, с помощью пастеровской пипетки, переносят в кюветы для колориметрирования. Колориметрируют в кюветах 3 мл при сине — зеленом светофильтре (с фильтром 490 нм). Качество образованного бактериями формазана рассчитывают по калибровочной кривой. Исследования проводят не менее чем в пятикратной повторности для статистической обработки полученных материалов. При этом значение доверительного коэффициента и в зависимости от этого показателя оценивают действие испытанной концентрации вещества.

Для построения калибровочной кривой готовят растворы формазана различной концентрации. Для приготовления основного раствора к 10 мг трифенилтетразолийхлорида добавляют 100 мг гидросульфита натрия и 2 — 5 мл фосфатного буфера с pH 7,4. Образовавшийся осадок формазана доводят толуолом до объема 20 мл. Основной раствор содержит 1000 мг формазана в 2 мл. Из основного раствора путем сочетания его различных объемов с толуолом готовят стандартные растворы с концентрацией формазана от 5 мкг до 500 мкг. Светопоглощаемость стандартных растворов измеряют на ФЭКе и по полученным данным строят кривую.

Метод оценки токсичности веществ по дегидрогеназной активности бактерий имеет ряд преимуществ. К их числу относят: экспрессность анализа, высокую чувствительность, высокую производительность, позволяющие иметь большое число повторностей для статистической обработки результатов, возможность количественно выразить эффект действия вещества.

Источник