Методика санитарно-гельминтологического исследования почвы.
1. Исследование почвы на яйца гельминтов.
Подготовка пробы к анализу.
Среднюю пробу почвы освобождают от посторонних включений; просеивают через сито с диаметром отверстий 2мм; измельчают в фарфоровой ступке с пестиком, обвязанный слоем резины. Подготовленную таким образом почву используют для дальнейшего анализа. Если требуется хранение почвы, измельченную пробу помещают в стеклянную банку, заливают 3% раствором формалина, приготовленного на физиологическом растворе( или 3% р-ра соляной кислоты), и хранят пробы при температуре 5-10С при частом перемешивании для аэрации(при таком хранении яйца гельминтов не развариваются).
Принцип метода основан на диспергировании почвы в растворе NaOH, флотации яиц гельминтов насыщенным раствором NaNO3 и дальнейшем микрокопировании поверхностной пленки флотоагента. Навеску 25,0 г почвы помещают в центрифужные пробирки объемом 250мл. и заливают 3%р-ом каливой или натриевой щелочью (соотношение1/2). Смесь тщательно размешивают при помощи электромешалки или стеклянных палочек в течении 5-8 мин и центрифугируют 5мин при 800 оборотов в минуту; надосадочную жидкость сливают, а почву промывают (от 1 до раз в зависимости от типа почвы) чистой водой до получения прозрачной надосадочной жидкости. После промывки к почве добавляют 150мл насыщенного раствора азотнокислого натрия ( уд. Вес 1,38-1,40), тщательно размешивают и центрифугируют . Пробирки устанавливают в штативе, доливают тем же раствором соли до уровня на 2-3мм ниже краев пробирки и покрывают предметными стеклами для снятия поверхностной пленки, концентрирующего яйца гельминтов.
При накрытие пробирок предметными стеклами оставляют с одного края пространство не более 10мм шириной, куда с помощью пипетки вносят насыщенный раствор соли до его соприкосновения с нижней поверхностью стекла. После этого предметное стекло осторожно передвигают до полного покрытия центрифужных пробирок. Через 20-25 мин. отстоя стекла снимают, переворачивая нижней поверхностью вверх.
К поверхностной пленке на предметных стеклах добавляют 3-4 капли 30% раствора глицерина, равномерно распределяют при помощи покровных стекол тонким слоем и микроскопируют, точно учитывая общее количество яиц гельминтов с обязательным соблюдением правильного и последовательного просмотра полей зрения. При необходимости приготовленные препараты можно хранить в холодильник до 5-7дней. При подсыхании препаратов по краям покровных стекол добавляют несколько капель 30% раствора глицерина.
Эффективность метода колеблется и зависит от типа обрабатываемой почвы, ее механического состава, содержания гумуса, илистых фракции, емкости поглощения.
2. Исследование почвы на личинки гельминтов (анкилостомидоз, стронкилоидоз).
Стеклянную воронку (диаметром 10-15см), соединенную при помощи резиновой трубки с узкой стеклянной пробиркой, устанавливают в штатив и наполняют водой (температура 45-50 градусов С). Почву в количестве 20-40 грамм на кусочке марли помещают на металлическую сетку, которую устанавливают на воронке так, чтобы нижняя часть почвы соприкасалась с водой. Воронку с почвой ставят в термостат при температуре 37 С. Личинки в силу своей термотропности мигрируют из почвы через сито в воду и оседают на дно пробирки.
Источник
О санитарно-паразитологических исследованиях почвы
Почва является одним из факторов передачи возбудителей паразитарных заболеваний (гельминтозов и протозоозов) у человека. Гельминтозы, передающиеся через почву (геогельминтозы), входят в число наиболее распространенных паразитарных болезней человека. В эпидемиологической классификации геогельминтозы выделены в отдельную группу заболеваний, для них характерно созревание яиц гельминтов до инвазионной стадии в почве. По оценкам ВОЗ, в мировом масштабе от геогельминтозов страдают примерно 2 млрд человек, в том числе 4 млн детей в Европейском регионе. Наиболее распространённым геогельминтозом в мире является аскаридоз.
Через почву люди могут заразиться трихоцефалёзом, токсокарозом, стронгилоидозом, анкилостомидозами и другими возбудителями паразитозов.
Методы лабораторного контроля за объектами окружающей среды предназначены для определения эффективности средств и методов дезинвазии, для осуществлением санитарно-паразитологического контроля органами и учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека мероприятий по охране окружающей среды от загрязнения паразитарными агентами; а также проводятся организациями в целях производственного контроля (п.1 МУК 4.2.2661-10 «Методы санитарно-паразитологических исследований»).
Отбор проб почвы, песка проводят в соответствии с ГОСТ 17.4.4.02-2017 «Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа»: «для гельминтологического анализа с каждой пробной площадки берут одну объединённую пробу массой 200г, составленную из десяти точечных проб массой 20г каждая, отобранных послойно с глубины 0-5 и 5-10см. При необходимости отбор проб проводят из глубоких слоёв почвы послойно или по горизонтам». В процессе транпортирования и хранения должны быть предприняты меры по предупреждению их вторичного загрязнения. Пробы для гельминтологического анализа доставляются в лабораторию сразу после отбора. При невозможности немедленного проведения анализа пробы хранят в холодильнике при температуре от 4 о С до 5 о С не более 7 суток.
В лабораторию доставляются пробы почв территорий для исследований на паразитологические показатели, установленные СанПиН 2.1.7.1287-03 «Санитарно-эпидемиологические требования к качеству почвы»: яйца и личинки гельминтов (жизнеспособных), экз/кг; цисты патогенных кишечных простейших, экз/100 г.
По степени эпидемической опасности почвы разделены на категории загрязнения. Оценкой степени эпидемической опасности является количество яиц геогельминтов экз/кг: чистая (о); допустимая (до 10 экз/кг); умеренно опасная ( до 100 экз/кг) ; опасная (до 100экз/кг) и чрезвычайно опасная ( выше 100 экз/кг). При обнаружении возбудителей гельминтозов определяют род или вид возбудителя; жизнеспособность.
В соответствии с п.3.2. СанПиН 2.1.7.1287-03 «В почвах на территориях жилой застройки не допускается по санитарно-паразитологическим показателям наличие возбудителей кишечных паразитарных заболеваний (геогельминтозы, лямблиоз, амебиаз и др.); яиц геогельминтов, цист (ооцисты) кишечных патогенных простейших». Лабораториями ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» в целях гигиенической оценки качества почв за 2017-2019г.г. на селитебных территориях Тульской области было отобрано 2362 пробы почвы (песка) из них 41 (1,7%) проба с паразитарным загрязнением. Доля проб почв в селитебной зоне, не соответствующих гигиеническим нормативам по паразитологическим показателям в Российской Федерации составляла -1,01% в 2017г.; 0,85% в 2018г.
Меры профилактики должны быть направлены на предотвращение загрязнения объектов окружающей среды экскрементами человека и животных и обеспечение дезинвазионных мероприятий, а также соблюдение мер личной гигиены.
Источник
Санитарно-гельминтологические исследования
При помощи санитарно-гельминтологических исследований обнаруживают яйца и личинки гельминтов в окружающей среде, определяют видовой, количественный состав, их жизнеспособность.
Исследование почвы на яйца гельминтов. Пробы почвы массой 100— 300 г отбирают на глубине 10—60 см вблизи выгребов, мусорных ящиков, на детских площадках и т. д. Заливают их 0,85% водным раствором натрия хлорида или 3% жидкостью Барбагалло и хранят до исследования в бытовом холодильнике. Срок хранения проб — не более 1 мес. Исследуют почву по методу Романенко (1968, 1982): 25 г почвы помещают в центрифужные пробирки объемом 250 мл, приливают 3% раствор натриевого или калиевого основания в соотношении 1:1. Полученную смесь тщательно размешивают, отстаивают в течение 20— 30 мин, после чего центрифугируют 5 мин при 800 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок промывают 1—5 раз до получения прозрачной надосадочной жидкости. Затем к осадку добавляют 150 мл насыщенного раствора азотнокислого натрия (относительная плотность — 1,38—1,40), тщательно размешивают и центрифугируют, после чего в каждую пробирку добавляют тот же раствор до уровня на 2—3 мм ниже их краев. Пробирки накрывают предметным стеклом так, чтобы оставался зазор шириной не более 10 мм, через который пипеткой добавляют раствор азотнокислого натрия до соприкосновения его с нижней поверхностью предметного стекла. Затем осторожно полностью закрывают предметным стеклом пробирку и после 20—25-минутного отстаивания стекло снимают и переворачивают его нижней поверхностью вверх. На место снятого стекла ставится второе, а при необходимости — и третье. На снятые стекла наносится капля 50% раствора глицерина, накрывается покровным стеклом и микроскопируется под световым микроскопом. Можно исследовать поверхностную пленку непосредственно в центрифужной пробирке под бинокулярным микроскопом МБС (Н. Л. Чекина, 1977).
На личинки гельминтов почву исследуют по методу Бермана.
Исследование воды на яйца гельминтов. Пробу воды отбирают и* водоемов в количестве от 0,5 до 10 л, что зависит от степени ее загрязнения, а из колодцев — от 20 до 25 л. Рекомендуется отбирать воду по« 0,5 — 1 л через каждые 3—5 мни. Содержащиеся в воде яйца концентрируют путем осаждения или фильтрации при помощи мембранных, бумажных или тканевых фильтров. Анализ воды осуществляют по методу Васильковой.
Исследование сточных вод на яйца гельминтов. Пробы сточной воды в условиях малых очистных сооружений отбирают на следующих этапах ее очистки: до поступления на очистные сооружения («сырая» вода), в отстойной части установки, контактном резервуаре, при впадении в биоируд или открытый водоем. На централизованных очистных: сооружениях воду отбирают до поступления на очистные сооружения,, после механической очистки, после вторичных отстойников, биологических прудов, полей фильтрации, земледельческих полей орошения. «Сырую» воду исследуют в количестве от 2 до 5 л, а в процессе искусственной биологической очистки и после завершения ее — от 10 до 15 л. Пробы отбирают через каждый час в течение суток (среднесуточная) или с 7 до 20 ч (среднедневная). Исследуют сточную воду по методу Романенко. Сточную воду наливают в стеклянный цилиндр емкостью 1—2 л, добавляют один из коагулянтов (сернокислые алюминий, железо или медь) в дозе 0,3—0,5 г/л и тщательно размешивают. Спустя 40—50 мин осветленную надосадочную жидкость удаляют сифоном, а осадок переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 3 мин при 1000 об/мин. Затем сливают жидкую часть, а к осадку приливают 2—4 мл 1—3% раствора соляной кислоты для растворения хлопьев коагулянта. Полученную смесь центрифугируют, удаляют жидкую часть, а осадок исследуют в дальнейшем по методике Романенко, применяемой для анализа почвы.
И. К. Падченко с соавторами (1982) разработал следующие методики исследования почвы, воды и сточных вод на яйца гельминтов.
Исследование почвы на яйца гельминтов. Отобранную пробу почвы (не менее 300 г) вносят в большую фаянсовую ступку, постепенно добавляют к ней 3% раствор натриевого или калиевого основания и тщательно растирают пестиком до образования гомогенной массы. Полученную смесь выливают в стеклянный цилиндр емкостью 10 л, предварительно наполненный на 3/4 объема водопроводной водой, и отстаивают в течение 5 мин. Всплывшие на поверхности смеси плотные примеси удаляют петлей с сеткой. После 5-минутного отстаивания надосадочную жидкость переливают сифоном в другой большой цилиндр, а образовавшийся осадок переносят в цилиндр емкостью 1 л и повторно отмывают водопроводной водой (не менее 2—3 раз). Образующуюся при этом в малом цилиндре надосадочную жидкость каждый раз переливают сифоном после 5-минутного отстаивания в большой цилиндр, где она смешивается с жидкой частью смеси, полученной после первого 5-минутного отстаивания. К собранной в большом цилиндре жидкости добавляют один из коагулянтов (сернокислый алюминий, сернокислое железо и др.) из расчета 0,3 г на 1 л жидкости и отстаивают ее 1—1,5 ч до полного просветления. Образовавшуюся надосадочную жидкость удаляют сифоном, а к осадку добавляют 1—3% раствор соляной кислоты для растворения хлопьев коагулянта. Полученную смесь отстаивают 18—24 ч, после чего жидкую часть удаляют сифоном, а осадок исследуют на яйца гельминтов. С этой целью осадок тщательно встряхивают и пастеровской пипеткой наносят 1 каплю полученной взвеси на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Исследуют не менее 1 мл осадка, а затем математически пересчитывают на весь его объем. При незначительном загрязнении проб почвы микроскопическому исследованию подлежит весь осадок.
Исследование сточной воды на яйца гельминтов. Пробы сточной воды, взятые на разных этапах ее очистки на очистных сооружениях, наливают в 10-литровые цилиндры и отстаивают 5 мин. Всплывшие на поверхность жидкости плотные примеси удаляют петлей. После 5-минутного отстаивания надосадочную жидкость переливают сифоном в другой большой цилиндр, а осадок удаляют. Полученную жидкую часть сточной воды смешивают в большом цилиндре с коагулянтом и исследуют в дальнейшем по той же методике, что и почву (на этапе добавления коагулянта).
Пробы воды из водопроводной сети и различных водоемов смешивают в большом цилиндре с коагулянтом и исследуют в дальнейшем по той же методике, что и сточную воду.
Исследование осадков сточных вод на яйца гельминтов. Пробы осадков сточных вод отбирают с 5—10 мест по 100 мл, помещают в стеклянные сосуды объемом 1—2 л. Сухие осадки забирают по той же методике, что и почву. Вносят 100—150 мл осадка в центрифужную пробирку объемом 250 мл, центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Затем жидкую часть сливают, а к осадку добавляют чистую воду до прежнего объема, тщательно размешивают и центрифугируют. Такую промывку осадка повторяют 2—3 раза, после чего к нему добавляют 3—5 г чистого песка и полученную смесь исследуют по той нее методике, что и почву.
Согласно нашим данным, осадок сточных вод исследуют на яйца гельминтов по следующей методике: пробу осадка в количестве 1 л тщательно растирают пестиком в большой фаянсовой ступке, постепенно добавляя к нему 3% раствор натриевого или калиевого основания, а в дальнейшем исследуют по той же методике, что и почву.
Исследование смывов на яйца гельминтов. Объекты внешней среды, подлежащие исследованию, смывают ватными тампонами, смоченными в 1% растворе натриевого основания или в 20% растворе глицерина. Тампоны смывают в центрифужные пробирки 2—3% раствором гидрокарбоната натрия или 1% раствором натриевого основания и центрифугируют. Полученный осадок микроскопируют.
Определение жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Жизнеспособность яиц и личинок гельминтов по внешнему виду определяют при помощи витальных красителей, методов культивирования и постановки биопроб на лабораторных животных.
Под световым микроскопом у мертвых или дегенерирующих яиц гельминтов оболочки разорваны или деформированы, цитоплазма разрыхлена, мутная. При подогревании зрелых яиц аскариды, власоглава, острицы до температуры +37° С личинки этих гельминтов проявляют активную подвижность.
Культивирование яиц и личинок гельминтов. Незрелые яйца аскариды культивируют при температуре +24. +30°С в чашках Петри (влажная камера) в 3% растворе формалина, приготовленном на 0,85% растворе натрия хлорида, а яйца власоглава — в 3% растворе хлористоводородной кислоты при температуре +30. +35°С, яйца остриц —в 0,85% растворе натрия хлорида при температуре Ч-37°С. Чашки Петри 1—2 раза в неделю открывают для аэрации и увлажняют в них фильтровальную бумагу чистой водой. Развитие яиц контролируют 2 раза в неделю по наличию признаков деления протопласта на отдельные бластомеры. В первые дни яйцо развивается до 16 бластомеров, переходящих в стадию морулы (вторая стадия). Если в течение 2—3 мес у янц не наблюдается признаков развития, их следует считать погибшими.
Источник