Элективные питательные среды для выращивания стафилококков тест

Диагностика и санация стафилококковых бактерионосителей

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации — Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 6 апреля 2001 г.

В методических рекомендациях представлена принципиально новая схема лабораторной диагностики стафилококковых бактерионосителей: цитоскопический метод выявления бактерионосителей стафилококков; питательная среда, позволяющая выделять стафилококки с персистентными свойствами; способ дифференциации стафилококковой микрофлоры, основанный на определении у штаммов, выделенных от бактерионосителей, факторов персистенции; предложены новые средства санации: масляный раствор витамина А, микроклимат спелеошахты, препарат электролизного водного раствора гипохлорита натрия.

Методические рекомендации предназначены для бактериологов, эпидемиологов, инфекционистов и врачей других специальностей.

Рекомендации разработаны сотрудниками Оренбургской государственной медицинской академии и Оренбургского института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (член-корреспондент РАН и РАМН, профессор О.В.Бухарин; профессор Б.Я.Усвяцов, доктор биологических наук О.Л.Карташова, кандидат биологических наук С.Б.Киргизова, кандидат медицинских наук Л.И.Паршута).

Введение

Настоящие методические рекомендации посвящены проблеме профилактики стафилококкового бактерионосительства.

В этиологической структуре внутрибольничных инфекций, возникающих в акушерских и хирургических стационарах, большая роль принадлежит стафилококкам. Основным источником гнойной стафилококковой инфекции являются бактерионосители.

Работами сотрудников Оренбургской медицинской академии и Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (1989-1997) установлено, что факторы персистенции стафилококков (антилизоцимная, антиинтерфероновая, антикомплементарная активности), направленные на инактивацию защитных механизмов хозяина, обеспечивают длительное переживание бактерий и создают основу резидентного бактерионосительства.

В представленных методических рекомендациях предлагаются новые подходы к профилактике стафилококковых инфекций, включающие: цитоскопический метод выявления бактерионосителей; питательную среду, позволяющую избирательно выделять стафилококки с персистентными свойствами; способ дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры, основанный на определении факторов персистенции у штаммов, выделенных от бактерионосителей.

Учитывая то обстоятельство, что подавление персистирующих свойств возбудителя затрудняет его паразитирование и тем самым повышает эффективность лекарственных воздействий, разработаны эффективные способы санации через снижение персистентных характеристик стафилококка.

Апробация предлагаемых методик в лечебно-профилактических учреждениях города показала их преимущество по сравнению с классическими методами профилактики.

Приоритетность способов диагностики и санации стафилококковых бактерионосителей подтверждена 2 авторскими свидетельствами и 4 патентами РФ на изобретения.

Диагностика стафилококковых бактерионосителей

Предлагаемый метод диагностики стафилококкового бактерионосительства отличается от существующих принципиально новой схемой исследования, включающей в себя: цитоскопический метод выявления бактерионосителей стафилококков; посев на питательную среду, позволяющую избирательно выделять стафилококки с персистентными свойствами (патент РФ N 2088668 «Питательная среда для выделения стафилококков с персистентными характеристиками»); способ дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры, основанный на определении факторов персистенции у штаммов, выделенных от бактерионосителей.

Цитоскопический метод

1. Реактивы, приборы, стекло

1.1. Среда-199 — официнальная среда для сохранения культуры клеток, производится в Свердловском НИИ вирусных инфекций.

1.2. Пробирки, ГОСТ 10515*, диаметр 15 мм, высота 145-150 мм

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 25336-82, здесь и далее по тексту. — Примечание изготовителя базы данных.

1.4. Пастеровские пипетки

1.5. Предметное стекло

1.7. Ватный тампон, укрепленный на проволоке

2. Метод заключается в следующем:

2.1. Исследуемый материал (клетки эпителия слизистой оболочки переднего отдела носа) забирают с помощью стерильных ватных тампонов, смоченных в физиологическом растворе.

2.2. Тампон погружают в стерильную пробирку с 1,0 мл среды-199, встряхивают в течение 15 минут, тампон отжимают о стенки пробирки и удаляют.

2.3. Содержимое пробирки инкубируют в течение 1-2 часов при 37 °С в термостате (для сохранения жизнеспособности эпителиальных клеток и размножения в них стафилококков).

2.4. Верхний слой жидкости удаляют при помощи пастеровской пипетки, из осадка делают мазок на чистое, хорошо обезжиренное стекло (стекла обезжиривают при помощи смеси Никифорова).

2.5. После подсыхания мазок фиксируют метанолом в течение 5 минут и окрашивают одним из принятых методов (синькой Мансона, по Романовскому-Гимзе и др.).

2.6. При микроскопии мазков просматривают не менее 30 эпителиальных клеток (учитывают клетки с хорошо видимым ядром). В том случае, если обнаруживают 5 и более клеток, содержащих микроколонии стафилококков (группа из 4 и более кокков), то делают заключение о резидентном бактерионосительстве.

2.7. Для уточнения видовой характеристики стафилококков проводят бактериологическое исследование.

Бактериологический метод

А. Выделение чистой культуры стафилококка с персистентными свойствами путем посева на элективную питательную среду с фузидином

1. Реактивы, приборы, стекло

1.2. Натрий хлористый, ГОСТ 4233-77 (Михайловский завод химреактивов)

1.3. Куриное яйцо

1.4. Фузидин-натрий-натриевая соль фузидиевой кислоты (Пензенский комбинат медицинских препаратов «Биосинтез»)

1.5. Питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой, код ОКП 93 8511 0197 ФС 42-188 ВС-88 (НПО «Питательные среды», Махачкала)

1.6. Физиологический раствор (9 г NaCl на 1 л воды)

1.7. Ватный тампон, укрепленный на проволоке

2. Элективная питательная среда (приготовление и посев)

2.1. Приготовление элективной среды: к 850 мл расплавленного мясо-пептонного агара добавляют 85 мл NaCl, затем среду стерилизуют, остужают до 50 градусов и добавляют 150 г желточной взвеси (желток асептически извлекают из яйца, взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия). Перед заливкой чашек Петри во флаконы вносят 0,0002 г/л антибиотика фузидина. Все тщательно перемешивают, готовую среду разливают в стерильные чашки, подсушивают в термостате при 37 °С в течение 10 минут.

2.2. На поверхность среды засевают исследуемый материал (клетки эпителия слизистой оболочки носа), который забирают с помощью стерильных ватных тампонов, смоченных в физиологическом растворе, и учитывают результаты через 24 часа инкубации в термостате при 37 °С.

2.3. Рост колоний на данной среде позволяет отнести бактерионосителя к резидентному типу, т.к. имеет место преимущественный рост стафилококка с персистентными свойствами.

Б. Идентификация чистой культуры; определение резидентной стафилококковой микрофлоры

При дифференциации резидентной стафилококковой микрофлоры от транзиторной, кроме учета микробной обсемененности, рекомендуется определять у выделенных штаммов чувствительность к фузидину, а также персистентные свойства (антилизоцимная, антиинтерфероновая, антикомплементарная активности), как наиболее информативные биологические характеристики (А.с. СССР N 1449587 «Способ выявления возбудителя при гнойно-воспалительных процессах»; патент РФ N 2010860 «Способ определения антикомплементарной активности микроорганизмов»).

1. Реактивы, приборы, стекло

1.2. Питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой, код ОКП 93 8511 0197 ФС 42-188 ВС-88 (НПО «Питательные среды», Махачкала)

1.3. Физиологический раствор (9 г NaCl г на 1 л воды)

1.4. Официнальные диски с фузидином (Минмедпром РФ объединение «Мосмедпрепарат» им. А.Я.Карпова)

1.5. Яичный лизоцим, регистрационный номер 76/506/6 (Фармацевтическое акционерное общество «Ферейн», Москва)

1.6. Культура Micrococcus luteus (N 211001 по каталогу ГИСК им. Л.А.Тарасевича)

1.7. Препарат человеческого лейкоцитарного интерферона (ПО «Иммунопрепарат», Уфа)

Источник

Элективные питательные среды для выращивания стафилококков тест

Глава 14. Стафилококки

Впервые стафилококки были обнаружены Л. Пастером в 1897 г. Подробно они были изучены А. Огстоном (1882) и Ф. Розенбахом (1884).

Морфология. Стафилококки (от греч. staphyle — виноградная гроздь) имеют вид круглых шаров диаметром 0,5-1,5 мкм. Размножаясь, образуют скопления в виде грозди винограда. Такая форма является результатом деления микробов в различных плоскостях. Однако в гное встречаются единичные и парные кокки. Стафилококки неподвижны, не имеют спор, при специальных условиях культивирования образуют микрокапсулу, грамположительны.

Культивирование. Стафилококки — факультативные анаэробы, однако лучше растут в присутствии кислорода. Растут и размножаются на обычных питательных средах, хорошо растут на средах с кровью, оптимальные условия — температура 37° С, рН 7,2-7,4.

Элективными средами являются желточно-солевой агар и солевой агар. На МПА колонии стафилококка выпуклые, круглые, непрозрачные, блестящие, размером 2-4 мм с ровными краями. При росте стафилококки образуют пигмент: золотистый, лимонно-желтый или белый. Лучше всего пигмент образуется на молочной среде при комнатной температуре и рассеянном свете. Стафилококковый пигмент не растворяется в воде, растворяется в ацетоне, эфире, спирте и т. д. При росте некоторых штаммов стафилококка на агаре с кровью вокруг колонии образуется зона гемолиза. Рост на бульоне характеризуется равномерным помутнением и осадком на дне.

Ферментативные свойства. Стафилококки вырабатывают сахаролитические и протеолитические ферменты. Сахаролитические ферменты расщепляют ряд сахаров: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, глицерин и другие с образованием кислоты.

Протеолитические свойства стафилококка выражаются в способности растворять казеин, разжижать желатин (медленно), расщеплять другие белковые субстраты.

Стафилококки продуцируют ферменты патогенности: 1) коагулазу (сворачивает плазму крови); 2) гиалуронидазу (фактор распространения); 3) лецитиназу (растворяет лецитин оболочки клеток); 4) фибринолизин (лизирует фибрин); 5) ДНКазу (деполимеризует ДНК); 6) фосфатазу и др.

Наличие плазмокоагулазы позволяет дифференцировать золотистый стафилококк от стафилококков других видов. Многие стафилококки вырабатывают пенициллиназу, разрушающую пенициллин.

Токсинообразование. Стафилококки вырабатывают экзотоксины. К их числу относятся гемолизины четырех типов, из которых наибольшее значение имеет α-токсин. Он обладает следующими свойствами: гемолитическим — вызывает гемолиз эритроцитов, дермонекротическим — при внутрикожном введении вызывает некроз, летальным — при внутривенном введении приводит к гибели чувствительных к нему животных.

Кроме гемолизинов стафилококки образуют лейкоцидин, убивающий лейкоциты, энтеротоксины шести типов, вызывающие пищевые отравления, эксфолиатины двух типов, приводящие к отслаиванию эпидермиса у новорожденных детей.

Антигенная структура. Стафилококки имеют протеиновый антиген А, общий для всех золотистых стафилококков, и полисахаридные антигены: А, Б, С.

Стафилококки выделяют бактериоцины (стафилоцины), которые обладают антагонистическим действием по отношению к микроорганизмам данного рода.

Среди золотистых (реже эпидермальных) стафилокков различают около 40 фаговаров. Определение чувствительности выделенных из различных объектов стафилококковых культур к типовым фагам имеет важное эпидемиологическое значение (при установлении источника и путей передачи возбудителя).

Классификация. В настоящее время стафилококки, выделенные от человека, делят на 3 вида (табл. 23): S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus.

Таблица 23. Дифференциация видов стафилококков, выделенных от человека

Примечание. + наличие ферментации, устойчивости, — отсутствие ферментации, устойчивости.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Стафилококки довольно устойчивы, поэтому они обнаруживаются в воздухе, почве, воде, на предметах обихода. При температуре 100° С они погибают моментально, при температуре 70° С — через 10-15 мин. Они хорошо переносят низкие температуры. При замораживании сохраняют жизнеспособность в течение нескольких лет. Хорошо переносят высушивание. Прямой солнечный свет убивает их только через несколько часов. Обычные растворы дезинфицирующих веществ (например, сулема в разведении 1:1000) убивают их через 15-20 мин. При обезвреживании выделений, содержащих гной, белок, мокроту, не следует применять фенол. Это дезинфицирующее вещество вызывает коагуляцию белков, что предохраняет микроорганизмы от гибели. Стафилококки чувствительны к бриллиантовому зеленому.

Восприимчивость животных. К стафилококку чувствительны крупный и мелкий рогатый скот, лошади, свиньи, куры. Из экспериментальных животных — кролики, белые мыши и котята.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-капельный, воздушно-пылевой, пищевой.

Заболевания у человека. Пиодермия, фурункулы, карбункулы, панариции, абсцессы; воспалительные процессы различных органов и тканей; ангины, циститы, остеомиелиты, холециститы, маститы; сепсис и септикопиемия; пищевые токсикоинфекции и многие другие. Описано около 120 нозологических форм стафилококковой этиологии.

Патогенез. Стафилококки проникают через кожу и слизистые оболочки.

Преимущественное значение при стафилококковых заболеваниях имеет золотистый стафилококк (S. aureus). Менее выражена роль в патологии человека S. epidermidis и S. saprophyticus. Патогенез обусловливается свойствами возбудителя — ферментами, экзотоксинами, веществами бактериальной клетки и состоянием иммунной системы макроорганизма.

Чаще поражается кожа и подкожная клетчатка — возникают пиодермиты, фурункулы, панариции. Нередко стафилококки обусловливают вторичные заболевания, например пневмонию при гриппе. Они также вызывают раневые инфекции. Особенно велика роль стафилококков в акушерской практике, так как новорожденные очень чувствительны к ним. В течении стафилококковых заболеваний имеет значение развитие аллергии, поэтому заболевание характеризуется рецидивами.

Особое место среди стафилококковых заболеваний занимают пищевые интоксикации. Клинически они протекают как токсикозы, сопровождаются рвотой, поносом, головной болью и другими явлениями.

Иммунитет. У человека имеется естественная резистентность, связанная с механическими факторами, фагоцитозом и наличием антител. Воспалительный процесс, возникающий в месте внедрения возбудителя, обусловливает задержку стафилококков и затрудняет их распространение по организму. В образовавшемся очаге стафилококки подвергаются фагоцитозу.

Образующийся в процессе заболевания антитоксин является важным фактором в общем комплексе иммунитета. Однако приобретенный иммунитет нестойкий, поэтому наблюдаются рецидивы.

Профилактика. Сводится к улучшению санитарно-гигиенических условий, активному выявлению больных и бактерионосителей, правильному режиму работы больничных учреждений.

Специфическая профилактика. Стафилококковый анатоксин и антистафилококковый иммуноглобулин.

Лечение. Антибактериальные препараты, поливалентный стафилококковый бактериофаг, антистафилококковая плазма и иммуноглобулин. В некоторых случаях при хроническом течении стафилококковых инфекций применяют аутовакцину.

Контрольные вопросы

1. По какому признаку кокки объединены в одну группу?

2. Какие ферменты и факторы патогенности продуцируют стафилококки?

3. Какие заболевания вызывают стафилококки?

4. Какие виды стафилококков Вы знаете?

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выделение и идентификация стафилококков.

1. Гной (фурункулы, карбункулы, абсцессы).

2. Слизь из зева (ангина).

3. Мокрота (пневмония).

4. Моча (пиелиты и циститы).

5. Дуоденальное содержимое (холецистит).

6. Кровь (подозрение на сепсис).

7. Рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты (пищевые отравления).

8. Слизь из носа (обследование на бактерионосительство).

Способы сбора материала

Первый день исследования

Все посевы ставят в термостат на сутки.

Обнаружение стафилококков при микроскопии гноя из закрытого абсцесса и осадка мочи, взятой катетером, позволяет дать предварительный положительный ответ: обнаружен стафилококк.

Посевы на плотных и жидких питательных средах вынимают из термостата и изучают. Подозрительные в отношении стафилококка колонии, выросшие на желточно-солевом агаре, отсевают на скошенный агар для получения и дальнейшего изучения чистой культуры. При этом учитывают наличие лецитиназы, которое проявляется в образовании радужного венчика вокруг колонии. Чашки с оставшимися колониями оставляют на 2-3 дня при комнатной температуре для выявления пигмента. Просматривают посевы на чашках с агаром, содержащим кровь. Колонии с четкой зоной гемолиза (просветление) вокруг них выделяют на скошенный агар. Посев крови в сахарном бульоне инкубируют 10 сут, производя через 2-3 дня высевы на агар с кровью и желточно-солевую среду.

При отсутствии роста на плотных питательных средах делают высев из бульона с глюкозой на агар с кровью. Посевы ставят в термостат на сутки.

Вынимают посевы из термостата. Из выделенных на скошенный агар культур делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамположительных стафилококков проводят дальнейшее изучение выделенной культуры:

а) ставят реакцию плазмокоагуляции;

б) изучают гемолитические свойства;

в) определяют продукцию ДНКазы;

г) определяют ферментацию маннита в анаэробных условиях;

д) определяют устойчивость к новобиоцину.

Реакция плазмокоагуляции. Цитратную плазму, полученную из крови кролика, разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:4 и наливают в две преципитационные пробирки по 0,3-0,5 мл. В одну пробирку вносят петлю исследуемой культуры, другая пробирка служит контролем. Обе пробирки ставят в термостат при температуре 37° С. Учет реакции производят через 2-3 ч. При отсутствии свертывания плазмы посевы оставляют при комнатной температуре на 24 ч, после чего учитывают реакцию. При наличии фермента коагулазы плазма свертывается (не выливается из перевернутой пробирки). В контрольной пробирке консистенция плазмы не изменяется.

Ускоренный метод определения коагулазы. В стерильной капле воды на предметном стекле суспендируют выделенную культуру, к ней прибавляют одну каплю неразведенной плазмы. При положительной реакции из микробных клеток в течение 20-60 с образуются крупные хлопья. Этот метод используют при массовых обследованиях.

Определение гемолитических свойств. Производят посев на агар с 5% крови (штаммы, продуцирующие α-гемолизин, дают зоны просветления среды и на кроличьей и на бараньей крови, продуцирующие β-гемолизин лизируют только эритроциты барана).

Определение ДНКазы. Исследуемую культуру засевают на среду, содержащую ДНК. Посевы инкубируют. Через 18-20 ч на чашку с выросшими колониями стафилококка добавляют 5-7 мл раствора хлороводородной кислоты. ДНК реагирует с кислотой и среда становится мутной. Если выделенная культура продуцирует фермент ДНКазу, он деполимеризует ДНК и помутнение не образуется.

Расщепление маннита в анаэробных условиях. Исследуемую культуру засевают уколом на полужидкий агар с маннитом. Поверхность среды заливают вазелиновым маслом. Инкубируют 18-24 ч при 37° С. Положительная реакция характеризуется изменением цвета среды (в среде имеется индикатор).

Производят учет результатов (табл. 24).

Таблица 24. Свойства золотистого стафилококка

Примечание. + положительная реакция.

Наличие перечисленных признаков позволяет отдифференцировать золотистые стафилококки от стафилококков других видов и дать окончательный ответ: выделен S. aureus (рис. 37).

Рис. 37. Схема выделения и идентификации стафилококка

Для установления эпидемиологической цепочки выделенную культуру фаготипируют. Фаготипирование может подтвердить идентичность стафилококков, выделенных от разных больных и из объектов внешней среды.

Для фаготипирования используют критические тест-разведения фагов. Критическим тест-разведением называют то максимальное разведение фагов, при котором происходит полусливной лизис соответствующего штамма стафилококка.

Методика фаготипирования. В чашку Петри наливают 20 мл 1,5% МПА, дают ему застыть и подсушивают в термостате в течение 30-40 мин. На поверхность агара наносят 1 мл 4-6-часовой культуры выделенного стафилококка, распределяют по поверхности всей чашки, избыток жидкости отсасывают или дают ей испариться в термостате в открытой чашке. Предварительно дно чашки делят на секторы или квадраты. Число квадратов или секторов должно соответствовать количеству используемых фагов. Затем на каждый квадрат или сектор наносят один фаг.

Чашки ставят в термостат при температуре 37° С. Результаты определяют через 6-7 ч. Если чашки оставляют при комнатной температуре, то учет фаголизиса производят через 18-24 ч.

Биологические пробы. Проба на определение летальных свойств культуры. Для выявления летального действия токсина кролику вводят внутривенно (или внутрибрюшинно) фильтрат бульонной культуры стафилококка из расчета 0,1-0,2 мл фильтрата на 1 кг массы кролика. Гибель кролика через 3-4 дня свидетельствует о наличии летального действия токсина.

Дермонекротическая проба. Пробу ставят на кролике (наиболее чувствительному к этому токсину животному). Предварительно на боку или на спине животного выщипывают шерсть и вводят внутрикожно 0,2 мл двухмиллиардной взвеси стафилококковой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида. При наличии в выделенной культуре некротических свойств в месте введения образуется инфильтрат, сопровождающийся некрозом.

Реакцию учитывают через 24-18 ч.

Полученную культуру стафилококка проверяют на чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков (см. главу 9).

Контрольные вопросы

1. Какой материал исследуют при заболеваниях, вызываемых стафилококками?

2. Каковы основные методы лабораторного исследования для выявления стафилококков?

3. Какова методика постановки реакции плазмокоагуляции?

4. На какой среде выявляют гемолитические свойства стафилококков?

5. С какой целью проводят фаготипирование?

Задание

Проверьте, к какому антибиотику чувствительна выделенная культура стафилококка.

Желточно-солевой агар Чистовича. Готовят желточную смесь (1 желток куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). К мясопептонному солевому агару (8-10% натрия хлорида), растопленному и остуженному до 45° С, добавляют 20% желточной взвеси (соблюдают стерильность) и разливают в чашки.

Агар с кровью. См. главу 7.

Солевой бульон, солевой агар. Готовят как обычные среды — МПБ и МПА, только натрия хлорид вносят в большем количестве (8-10%). Бульон разливают в колбы, пробирки, агар — в чашки.

Будьте одним из тех счастливчиков, которые приобретут качественное прислуживание от самых реальных шлюх. Всегда проститутки с вашего региона ежемесячно удовлетворяют мужчин разными способами .

Источник