Элективные среды для выращивания микобактерий туберкулеза

Бактериологические методы

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 «О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений» подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения.

При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 — 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения — возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.

Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.

К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.

При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 — 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).

Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).

Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

Рисунок 1

Микобактерии туберкулеза
а — метод окраски по Цилю-Нельсену
б — метод люминисцентной микроскопии
в — клетки Лангхаса
г — эпителиоидные клетки

Культуральный метод

Наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза в нашей стране является культуральный метод. Это «золотой стандарт» бактериологической диагностики туберкулеза, так как чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для её последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости. Этот метод дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их обнаружение может быть зарегистрировано только через 3 недели культивирования.

Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, «Новая», Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4 — 8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.

Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.

Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.

Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования — от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.

Системы BACTEC

Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов — применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической (Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1 — 2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10 — 14 суток.

Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, «погашенный» высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и «вручную», тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.

Основным недостатком BACTEC MGIT, как и других систем BACTEC, является высокая стоимость оборудования (до 100000 долларов США) и флаконов с питательной средой — посев одной пробы диагностического материала стоит до 400 рублей.

Посев на L -формы микобактерий

Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.

Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.

Источник

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ПРИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20

Описание патента на изобретение RU2366700C1

Изобретение относится к микробиологии, в частности к производству питательных сред, и может быть использовано в медицине и ветеринарии при диагностике туберкулеза.

Известны яичные среды для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза, среды: Петраньяни, Гельберта, Левенштейна-Йенсена. Расход яиц на приготовление вышеприведенных сред составляет 10-16 штук на 1 л среды («Наставление по диагностике туберкулеза животных», МСХ РФ Департамент ветеринарии, М., 2002, с.44-48).

Известна яичная среда Финн-2 для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза, которая в бактериологической диагностике (согласно многим исследованиям) характеризовалась более высокой эффективностью. Питательная среда Финн-2 содержит солевую основу, включающую:

— магний сернокислый — 0,5 г;

— натрий лимоннокислый — 1,0 г;

— квасцы железоаммиачные — 0,05 г;

— калий фосфорнокислый однозамещенный — 20,0 г;

— алюминий лимоннокислый однозамещенный — 5,0 г;

— натрий глутоминовокислый однозамещенный — 10,0;

— глицерин — 20 мл;

— вода дистиллированная — до 1000 мл.

Ингредиенты растворяют в указанной последовательности в теплой дистиллированной воде при pH 6,3-6,5. Раствор стерилизуют при 1 атм в течение 20 минут. Цельные яйца в количестве 40 штук (2000 мл) гомогенизируют до образования однородной массы, в которую добавляют 33 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и 1 литр солевого раствора. Смесь фильтруют, разливают по пробиркам и свертывают при температуре 85°С в течение 30 минут (см. там же среда Финн-2 — прототип).

Однако использование яичных сред для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза характеризуется большим расходом яиц, являющихся одним из основных продуктов питания человека. Кроме этого в связи с эволюционной изменчивостью возбудителя, бесконтрольным применением лекарственных средств и биопрепаратов снизилась информативность бактериологических исследований при туберкулезе.

Необходима разработка питательной среды, позволяющей сократить расход яиц при производстве питательных сред и повысить их информативность.

Указанный технический результат достигается тем, что питательная среда, включающая солевую основу, яйца, водный 2%-ный раствор малахитовой зелени, дополнительно содержит пантолизат на основе пантового шрота, являющегося побочным продуктом при производстве пантокрина. Питательная среда представлена следующим соотношением компонентов, мл:

— солевая основа — 1000;

— яйца (20-34 мг) — 1700-1000;

— 2%-ный раствор малахитовой зелени — 33

Пантолизат готовят экстракцией смеси шрота и воды в соотношении шрот:вода 1:4-1:5, температуре процесса 98-99°С под давлением 1,5 атм в течение 3-4 часов.

Химический анализ пантового шрота показывает, что в пантокрин при его производстве переходит всего 3% сухого вещества пантовой муки (размолотого панта). 90% суммарного содержания аминокислот и 30% липидов остаются в пантовом шроте. Таким образом, после водной экстракции пантового шрота в пантолизате находится достаточное количество аминокислот, микро- и макроэлементов и липидов. Качественный состав липидов представлен в пантолизате фосфолипидами, стеринами, жирными кислотами, триглицеридами, эфирами стеридов. Микобактерии весьма устойчивы к воздействию факторов внешней среды и химическим веществам, именно из-за наличия в микробной клетке жировосковых веществ. В отличие от других микроорганизмов микобактерии туберкулеза характеризуются высоким содержанием липидов, достигающим 10-40% сухого вещества микобактерий. Фосфолипиды составляют около 20% от всех липидов микобактерий. В растущих клетках микобактерий происходит как синтез, так и расщепление фосфолипидов, являющихся существенными структурными элементами клеточных стенок микобактерий. Глицериды и воски служат запасными внутриклеточными веществами: когда клетка использует весь субстрат среды, она начинает потреблять внутренние резервы. Таким образом, увеличение липидной составляющей в модифицированной среде Финн-2, при более высоком и более разнообразном аминокислотном ее составе, является новой питательной средой, которая должна обеспечить наиболее высокую интенсивность и качественные показатели роста микобактерий.

Для разработки модифицированной среды на основе питательной среды Финн-2 15%, 25 и 50% яичной массы заменяли на равное количество пантолизата, с условием, что объем 1-го яйца — 50 мл, при прежнем количестве солевой основы и 2%-ного раствора малахитовой зелени.

Результаты исследований отражены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, замена 15, 25 и 50% яичной массы на пантолизат существенно повлияла на улучшение ростовых качеств при выращивании М. bovis и микобактерий из биоматериала от морской свинки. При выращивании М. flavescens (являющейся одной из многочисленных в количественном отношении микобактерий, изолированных из биоматериала маралов (18,8%) и обуславливающих сенсибилизацию животных к туберкулезу) ростовые качества среды не уступают данным показателям среды Финн-2 (контроль).

Сроки появления первичных колоний М. bovis были одинаковы на всех испытуемых средах (6 суток), однако на среде Финна-2 первичный рост на 6 сутки был отмечен лишь в 6 пробирках из 10 (60%), как и на модифицированной среде при 50%-ной замене яичной массы на пантолизат (3 опытная среда), в то время как на 1 и 2 опытных средах (при 15 и 25%-ной замене) первичный рост на 6 сутки наблюдался в 8 пробирках из 10 (80%). В дальнейшем во всех 40 пробирках происходил интенсивный рост колоний, однако сроки накопления бактериальной массы в 1 и 2 опытных группах были значительно меньше. На 21 сутки на среде по прототипу было отмечено 75 точечных колоний (в среднем на одну пробирку), на 1, 2, 3 опытных средах уже на 16, 17 и 19 день этот показатель составил 150, 147 и 100 колоний соответственно.

Высокая результативность опытных сред наблюдалась и при изоляции М. bovis из биоматериала от морской свинки (органы с характерными изменениями). Интенсивный рост культур был обнаружен на 5 (21-16) суток раньше на 3 опытной среде при наличии 95 точечных колоний и на 6 суток раньше на 1 и 2 опытных средах при наличии 140 и 136 точечных колоний, в отличие от прототипа (среда Финн-2), где на 26 сутки насчитывалось всего 87 колоний.

Как видно из таблицы 1, испытания опытных сред были проведены на средах от 15 до 50%-ной замене яичной массы на пантолизат и, поскольку с увеличением процента замены от 25 до 50 несколько снижалась результативность показателей роста по сравнению с 25%-ной заменой, исследования с еще более высоким процентом замены следовало считать нецелесообразным, тем более что показатели роста на 3 опытной среде (50% замены) были хотя и несколько выше, но очень близки показателям по прототипу (среда Финн-2). Таким образом, опытные среды с 15-50%-ной заменой яичной массы на пантализат заметно стимулирует рост микобактерий, повышая информативность питательной среды.

Пример 1. Модифицированную питательную среду готовят следующим образом:

1) 1 литр солевой основы (включающей 0,5 г магния сернокислого (MgSО₄·7H₂О), 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,05 г квасцов железоаммиачных, 20 г калия фосфорнокислого однозамещенного (K₂НРО₄), 5,0 г аммония лимоннокислого однозамещенного, 20 мл глицерина (С₃Н₈О₃), и растворенных в указанной последовательности в теплой дистиллированной воде) стерилизуют при 1 атм в течение 20 минут.

2) 20 цельных яиц моют в теплой воде с мылом, обрабатывают спиртом, разбивают в стерильную колбу и взбалтывают до образования однородной массы.

3) 2 г малахитового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 30 минут.

4) К 1000 мл яичной массы (20 яиц, т.е 50%-ная замена яиц пантолизатом), смешанной с 1000 мл пантолизата добавляют 33 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и 1000 мл солевого раствора. Смесь фильтруют через марлевый фильтр, разливают в пробирки по 4-5 мл и свертывают при температуре 85°С в течение 30 минут.

Пример 2. Технология приготовления ингредиентов и модифицированной питательной среды по примеру 1. Соотношение ингредиентов:

— солевая основа — 1000 мл;

— яичная масса (30 яиц, т.е 25%-ная замена яичной массы на пантолизат) — 1500 мл;

— пантолизат — 500 мл;

— 2%-ный раствор малахитовой зелени — 33 мл.

Пример 3. Технология приготовления ингредиентов и модифицированной питательной среды по примеру 1. Соотношение ингредиентов:

— солевая основа — 1000 мл;

— яичная масса (24 яйца, т.е. при 40% замены яичной массы на пантолизат) — 1200 мл;

— пантолизат — 800 мл;

— 2%-ный раствор малахитовой зелени — 33 мл.

Пример 4. Технология приготовления ингредиентов и модифицированной питательной среды по примеру 1. Соотношение ингредиентов:

— солевая основа — 1000 мл;

— яичная масса (34 яйца, при 15%-ной замене яичной массы на пантолизат) — 1700 мл;

— 2%-ный раствор малахитовой зелени — 33.

Таким образом, использование заявленной питательной среды для выращивания первичных культур микобактерий при бактериологической диагностике туберкулеза позволяет сократить расход яиц при производстве питательных сред и повысить их информативность.

Похожие патенты RU2366700C1

Реферат патента 2009 года ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ПРИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА

Питательная среда для выращивания первичных культур микобактерий включает солевую основу в составе: магний сернокислый — 0,5 г, натрий лимоннокислый — 1,0 г, квасцы железоаммиачные — 0,05 г, калий фосфорнокислый однозамещенный — 20,0 г, алюминий лимоннокислый однозамещенный — 5,0 г, натрий глутаминовокислый однозамещенный — 10,0, глицерин — 20 мл, вода дистиллированная — до 1000 мл, яичную массу, 2%-ный раствор малахитовой зелени и пантолизат пантового шрота, при следующем соотношении компонентов, мл: солевая основа 1000, яичная масса 700-1000, пантолизат 300-1000, 2%-ный раствор малахитовой зелени 33. Пантолизат пантового шрота готовят путем водной экстракции пантового шрота при соотношении шрот: вода 1:4-1:5, температуре процесса 98-99°С под давлением 1,5 атм в течение 3-4 ч. Это обеспечивает улучшение ростовых качеств среды и повышение ее информативности. 1 табл.

Источник