Культура клеток
Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных. Историческое развитие технологии и методик выращивания культур клеток неразрывно связаны с выращиванием тканевых культур и целых органов.
История
В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор, содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней. Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. В 1910 г. Пейтон Раус, работая с культурой клеток саркомы цыплёнка, индуцировал образование опухолей у здоровых животных. Позже это привело к открытию онкогенных вирусов (Нобелевская премия по физиологии или медицине 1966 г.).
Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведённых с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa.
Основные принципы культивирования
Выделение клеток
Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов, как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс. Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.
Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными. Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определённого количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.
Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации, но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путём активации гена теломеразы.
Культивирование клеток
Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др. Факторы роста, используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование заражённых ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста.
Клетки можно выращивать в суспензии, либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно изменённых таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности; это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения адгезивных свойств, а также для стимулирования роста и дифференцировки. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяются органотипические культуры клеток, которые представляют собой трёхмерную среду, в отличие от обычной лабораторной посуды. Эта система культивирования физически и биохимически наиболее сходна с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии). С целью обеспечения необходимых физических условий для культивирования адгезивных культур и заселения объёма внеклеточного матрикса тканеинженерных конструкций используются системы динамического культивирования на основе роторных и вихревых биореакторов, биореакторов с непосредственным на скаффолд: компрессионных биореакторов, биореакторов с механическим натяжением и гидростатическим давлением, специальных биореакторов для электростимуляции клеток и тканей, а также комбинированных биореакторов.
Перекрёстное загрязнение клеточных линий
При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения.
Особенности выращивания клеток
При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:
- Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
- Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
- Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
- По той же причине может начаться клеточное дифференцирование.
Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин, стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).
Одним из продуктов метаболизма в клетках являются кислоты, вследствие чего pH среды постепенно снижается. Для контроля кислотности питательных сред, в них добавляют индикаторы pH.
Если культура клеток адгезивная, питательную среду можно полностью заменять.
Пассирование клеток
Пассирование (разделение) клеток — это отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма. Суспензивные культуры пассировать проще, так как для этого достаточно всего лишь отобрать необходимое количество клеток, поместить их в другие сосуды, и добавить свежей питательной среды. Адгезивные же клетки перед этим следует отделить от субстрата и разделить их скопления. Чаще всего для этой цели используют смесь трипсина и ЭДТА или другие ферментные смеси, иногда достаточно только ЭДТА в физиологическом растворе (раствор Версена). Если культура растет медленно, её обычно подкармливают без переноса в другой сосуд, периодически (обычно раз в 2-3 дня) отбирая часть использованной среды и добавляя свежую.
Трансфекция и трансдукция
В клетки при их выращивании можно внедрять чужеродную ДНК путём трансфекции (невирусный метод). Часто данную технологию применяют для управляемой экспрессии генов. Сравнительно недавно для этих целей была успешно реализована трансфекция иРНК.
ДНК также может быть внедрена в геном клетки с помощью вирусов или бактериофагов. Они, являясь внутриклеточными паразитами, как нельзя лучше подходят для этих целей, так как внедрение генетического материала в клетку-хозяина является обычной частью их жизненного цикла. Этот метод называется трансдукция.
Линии клеток человека
Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики, поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета», согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удалённых с их согласия.
Гибридома
Гибридома — это линия клеток, полученная в результате слияния нормальных лимфоцитов с «бессмертными» раковыми клетками. Используется для получения моноклональных антител. Лейкоциты, выделенные из селезёнки или крови иммунизированных животных, производят антитела с необходимой специфичностью, но как у любой первичной культуры, их способность к пролиферации ограничена пределом Хейфлика. Для иммортализации их искусственно сливают с «бессмертной» линией клеток миеломы, в результате чего происходит рекомбинация признаков. После этого линию клонируют и отбирают клоны, способные одновременно к неограниченной пролиферации и производящие антитела против избранного антигена.
Использование клеточных культур
Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии.
Продукты биотехнологии
Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты, синтетические гормоны, моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин. Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений.
Тканевые культуры
Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo.
Вакцины
С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита, кори, эпидемического паротита, краснухи, ветрянки. Вследствие угрозы пандемии гриппа, вызываемого штаммом вируса H5N1, в настоящий момент правительство Соединённых Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.
Культуры клеток не млекопитающих
Культуры клеток растений
Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определённого баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов.
Бактериальные, дрожжевые культуры
Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара. Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).
Вирусные культуры
Культуры вирусов выращивают на культурах клеток млекопитающих, растений, грибов или бактерий, в зависимости от природного хозяина конкретного типа вирусов. Но при некоторых условиях могут быть выращены и в клетках другого типа.
В этом случае культура клеток сама служит средой для роста и репликации вируса.
Виды клеточных линий
Краткий перечень клеточных линий
Приведённый здесь список наиболее распространённых клеточных линий не является полным и исчерпывающим.
Источник
Этапы культивирования клеток животных
1. Диссоциация тканей – при этом из организованных тканей получают одиночные клетки. Их затем используют для получения первичных культур, т.е. культур численно увеличивающихся клеток. В качестве источника первичных клеток используют: почки обезьян, собак, кроликов, куриных эмбрионов 14-дневного возраста; клетки легких эмбриона человека 12-16-недельного возраста и клетки почек такого эмбриона. Предпочтение отдается эмбриональным клеткам. При получении клеток от более старых доноров их урожай и качество снижаются, так как в их органах накапливается соединительная ткань.
Сначала ткань тонко измельчают с помощью гомогенизатора, путем продавливания ткани через сетку из нейлона или нержавеющей стали или нарезают скальпелем или ножницами. Содержимое разрушенных клеток захватывает интактные клетки, при этом образуются желатиноподобные агрегаты. Поэтому проводят дополнительную обработку этих агрегатов ДНК-азой.
Для предотвращения развития микробов-контаминантов растворы, которые используются при диссоциации ткани, должны содержать антибиотики широкого спектра действия (гентамицин, неомицин) или более специфичные антибиотики (фунгизон).
Для диссоциации тканей применяют гидролитические ферменты, которые разрушают внеклеточный матрикс: трипсин, проназу, коллагеназу, эластазу, диспазу, гиалуронидазу или смеси ферментов.
2. Сепарация клеток. При диссоциации получаются смешанные популяции эндотелиальных, фибробластных и эпителиальных клеток. Для получения какого-то определенного типа кровяных клеток используют следующие методы:
· Селективная обработка ферментами.Так, в присутствии коллагеназы увеличивается доля эпителиальных клеток.
· Специфические ингибиторы. Так, например, этилмеркуритиосалицилат натрия и йодоуксусная кислота более токсичны для фибробластов.
· Центрифугирование: изопикническое центрифугирование – в градиенте плотности; зональное или дифференциальное центрифугирование – по скорости седиментации, т.е. по размеру.
· Физические методы: электрофорез; дифференциальное прикрепление клеток к стеклу (например, эндотелиальные клетки прикрепляются к стеклу быстрее фибробластов, а фибробласты – быстрее эпителиальных клеток); разделение клеток между двумя водными фазами полимера (например, система декстран-полиэтиленгликоль, в которой полиэтиленгликоль сосредотачивается в верхней, а декстран в нижней фазах).
· Сортировка клеток – дляэтого используют автоматы по сортировке и учету потока клеток (цитомеры), с их помощью можно различать и сепарировать клеточные органеллы, например хромосомы в метафазе.
3. Субкультивирование и сбор урожая. Для снятия монослоя клеток с субстрата применяются те же ферменты, что и для диссоциации тканей, чаще – трипсин. Перед добавлением трипсина клеточный пласт промывают фосфатно-солевым буферным раствором для удаления остаточных следов сыворотки.
Если жизнеспособные клетки не требуются (например, при сборе клеток для извлечения антигенов), то их собирают следующими способами: встряхивание со стеклянными бусами; соскабливание пласта шпателем или стержнем с резиновым покрытием; применение ультразвука; применение детергентных препаратов; замораживание и оттаивание.
4. Подсчет общего числа клеток. Для этого используют гемоцитомеры; электронный метод; прямой метод – определение массы клеток по содержанию в них белков, белкового азота или по сухому веществу при условии, если взятые клетки были полностью отмыты от сыворотки и других компонентов среды; косвенный метод – по изменению метаболических процессов; радиохимические методы.
5. Синхронизация роста. Для многих исследований требуются клетки в одной и той же фазе развития. Для получения таких клеток используют два метода:
· Блокирование (индукция) – при этом клетки блокируются в фиксированной точке жизненного цикла и накапливаются в данной фазе. Затем клетки высвобождают из образовавшегося блока (обычно промыванием) и далее обеспечивают их синхронное развитие. Для блокирования клеток применяют ингибиторы митоза (колцемид, винбластин); ингибиторы синтеза ДНК (тимидин, аметоптерин, 5-аминоурацил и гидроксимочевина). Частично синхронизируют клетки воздействием холодом, голоданием. Синхронизация обычно охватывает 20 — 50 % клеток. Увеличение достигается повтором блокирований.
· Селекция (сепарация) – при этом клетки извлекают из популяции физическими методами: митотическое «стряхивание» – основано на том, что во время митоза клетки монослоя округляются и слабее прикрепляются к субстрату и друг к другу; скоростное центрифугирование – при этом отселекционируют фракцию клеток одинакового объема и возраста. При этом синхронизируется 60-75% клеток.
6. Иммобилизация и микрокапсулирование клеток.Основная задача – стабилизация клеток и создание для них оптимальных условий. Клетки могут быть иммобилизованы адсорбцией; ковалентным связыванием; перекрестным связыванием; заключением в полимерные матриксы. Для этого используют желатин, полилизин, альгинат, агарозу. Такая техника обеспечивает защиту клеток при перевозке; длительное хранение клеток при 4ºС; исключение иммунного отторжения трансплантированных клеток; защиту хрупких клеток (например, гибридом) от механических воздействий. При культивировании инкапсулированных клеток легче производить смену среды в ферментере; регулировать соотношение объемов клеток и питательной среды; выделять продукты, свободные от клеток.
7. Консервирование клеток животных. Консервирование позволяет сохранить нужный геном в биотехнологии; сохранить посевной материал высокого качества; длительно сохранить запас клеток, имеющих ограниченную продолжительность жизни и не выдерживающих большое число пассажей; обеспечить генетические исследования запасом родительских клеток; сохранить резервный фонд клеток на случай утраты основного фонда; не подвергать клетки субкультивированию до того времени, пока это непосредственно не потребуется; сберечь затраты труда, питательные среды, а также уменьшить риск контаминации; проводить эксперименты по слиянию клонов без спешки.
Клетки животных не переносят лиофильной сушки (сублимация). Практически утрачивают жизнеспособность при температуре ниже -25ºС. Некоторые клетки выживают при -70ºС и даже при -140ºС. Наиболее распространенно хранение клеток в жидком азоте (температура – -196ºС). При этом клетки полностью стабильны.
В зависимости от скорости замораживания происходят последовательно или одновременно три явления образование кристаллов льда; удаление воды; повышение концентрации растворенных веществ. Повреждение клеток и утрату ими жизнеспособности могут вызвать образование внутриклеточного льда – это происходит при скорости охлаждения выше 100ºС/мин; высокая концентрация солей при пониженных скоростях охлаждения – менее 1ºС/мин.
Чтобы избежать значительных градиентов температуры в замораживаемой смеси, применяют как можно меньшие объемы замораживаемого материала. Обычно это стеклянные ампулы емкостью 1 мл. Если объем замораживаемого материала слишком большой, то используют пластиковые мешки, применяемые для хранения крови. При этом замораживаемый материал распределяется тонким слоем по большой поверхности. Это обеспечивает лучшие условия для теплообмена.
8. Восстановление жизненных функций. При оттаивании культуры её следует разогреть со скоростью не менее 400°С/мин. Когда клетки оттают, ампулу открывают и ее содержимое вносят в среду для выращивания с температурой 37°С.
Источник