Подготовка посевного материала
В биотехнологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты (грамположительные бактерии, не образующие спор), бактерии и водоросли в виде чистых и смешанных культур. В традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдается смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных процессов – монокультурам (чистым культурам), выращиваемых в асептических условиях. Большинство используемых сегодня культур получено из природных источников, однако затем эти культуры были улучшены или путем выращивания в условиях, характерных для данного процесса (для повышения выхода биомассы и первичных метаболитов), или с помощью мутагенеза или генетической инженерии (для производства вторичных метаболитов).
Посевным материалом (инокулятом) называют чистую культуру микроорганизма, которую получают путем ее последовательного пересева из пробирки в колбу, а затем в аппараты увеличивающегося объема до количества, необходимого для промышленного производства.
Хранение чистой культуры. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента – ключевая задача любого биотехнологического производства. Культуры микроорганизмов-продуцентов заводы получают из коллекций в пробирках на агаризованных питательных средах или в ампулах. Чистая культура микроорганизма может постоянно или по мере необходимости использоваться в производстве. При длительном хранении чистых культур могут происходить случайные нерегулируемые мутации. Для избежания мутаций следует не только соблюдать правила хранения и поддержания исходной культуры, но и периодически проводить пересев культуры и проверку ее однородности как по морфологическим, так и по физиологическим признакам.
На практике культуры хранят различными способами:
· на косом агаре при низкой температуре (1 – 5 °С) можно хранить культуру 1 – 2 мес;
· замораживание и хранение при температуре ниже – 20 °С позволяет сохранить культуру в течение нескольких месяцев, при условии строгого сохранения температурных режимов хранения;
· на твердых средах под слоем стерильного парафина или минерального масла можно хранить дрожжи, плесневые грибы –менее пригоден этот способ для хранения актиномицетов. Масло предохраняет культуру от высыхания идоступа кислорода;
· на агаре без добавления питательных веществ (допускаются очень незначительные добавки питательных веществ);
· лиофилизирование (культуру замораживают при температуре до – 80 °С (обычно при – 30 °С) и подвергают сублимации в вакууме. При этом происходит сублимация превратившейся в лед свободной воды или воды, непрочно связанной с гидрофильными веществами. Лед переходит из твердого состояния в парообразное, минуя жидкую фазу. Для предохраненияклеток от инактивации используют защитные среды (сыворотка крови, бульон, сахароза, смесь песка и глины и др.). Лиофилизированную чистую культуру в ампулах хранят в течение нескольких лет;
· хранение в стерильной смеси песка и глины заключается в следующем.Нанесенные на эту смесь микроорганизмы или суспензию спор сушат прикомнатной температуре и при такой же температуре хранят в посуде, закрытойватной пробкой.
Приготовление посевного материала состоит из следующих этапов:
1. Получение культуры микроорганизма в микробиологической лаборатории завода.
2. Выращивание микроорганизмов в малом посевном аппарате.
3. Выращивание микроорганизмов в большом посевном аппарате.
4. Накопление культуры микроорганизмов в малом ферментере.
Передачу чистых культур из одного аппарата в другой осуществляют в конце логарифмической фазы роста. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования.
Лабораторная стадия. Перед началом технологического процесса культуру размножают в лаборатории в стерильных условиях при оптимальном составе среды и режиме выращивания (рН, температура, длительность). С поверхности косого агара культуру стерильно переносят в колбы объемом 100 – 200 мл и инкубируют. Длительность каждой стадии выращивания 24 ч. Содержимое колб используют в качестве посевного материала для первого инокулятора цеха чистой культуры.
Иногда для уменьшения опасности заражения инфекцией в инокулятор культуру вносят прямо из пробирок. При этом длительность инокуляции увеличивается.
В производстве антибиотиков часто используют споровый материал. При этом в лабораторных условиях культуру размножают двумя способами:
· культуру продуцента высевают на косой агар, инкубируют до образования спор и смывают их стерильной водой. Суспензию спор снова переносят в свежую агаризированную среду для получения спорового материала второго поколения. Выросшие споры еще раз смывают стерильной водой и суспензию используют для получения первого вегетативного поколения продуцента на жидкой среде;
· культуру продуцента высевают на агаризованную среду для получения спор. Полученную суспензию спор сразу же вносят в колбы с жидкой средой и выращивают их на качалке. Полученный таким образом вегетативный материал продуцента первого поколения используют в качестве посевного материала для второго поколения продуцента в колбах с жидкой средой. Вегетативный материал второго поколения используют для внесения в инокулятор.
Инокуляционная стадия. Дальнейшее размножение посевного материала обычно идет в две стадии: в цехе чистой культуры и в отделе инокуляции.
Для приготовления посевного материала используют полноценную среду, тщательно проверенную различными химическими и микробиологическими методами. Культивирование микроорганизмов на питательной среде основного состава позволяет культуре быстро адаптироваться к окружающим условиям и компонентам питательной среды, при этом происходит активация ферментов, а также синтезируются новые ферментные системы. Количество питательной среды в аппарате не должно превышать 60 % общего объема Продолжительность приготовления посевного материала на этой стадии обычно не превышает 1 сут. Посевной материал для главной ферментации готовят в количестве 5 – 20 % объема используемой питательной среды.
Подготовленный посевной материал направляют на культивирование.
Дата добавления: 2016-10-26 ; просмотров: 8335 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
Источник
Получение посевного материала
СТАДИИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ
ТИПОВАЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА
Технологический процесс – это совокупность взаимосвязанных технологических операций, обеспечивающих переработку исходных материалов в готовые продукты. Для каждого процесса существует своя технология, но все стадии обычно приблизительно одинаковы:
— получение посевного материала;
— приготовление и стерилизация питательной среды;
— подготовка и стерилизация воздуха;
— ферментация и культивирование;
— отделение биомассы и выделение целевого продукта;
— очистка сточных вод и газовых выбросов.
Посевной материал – это чистая культура, размноженная до такого количества, чтобы ею можно было засеять промышленный ферментер.
Приготовление посевного материала в зависимости от вида продукта, его физиолого – биохимических особенностей состоит из нескольких последовательных этапов: исходная культура (в пробирке) → выращивание на скошенной агаризованной среде (в пробирках) → выращивание в колбах на качалке на жидкой среде (одна — две стадии) → выращивание в посевном аппарате (инокуляторе) → накопление культуры микроорганизмов в малом ферментере → посевной материал.
Выращивание посевного материала производится по следующим стадиям:
— получение культуры микроорганизма в микробиологической лаборатории завода;
— выращивание посевного материала в малом посевном аппарате (вместимостью 300 л);
— выращивание дрожжей в большом посевном аппарате (вместимостью 3200 л);
— накопление культуры дрожжей в малом ферментаторе (вместимостью 50м 3 ).
Первая стадия выращивания посевного материала осуществляется в заводской лаборатории. Исходную культуру размножают на скошенной агаризованной среде в пробирке в стерильных условиях при оптимальных составе питательной среды и режиме выращивания (рН, температура, длительность).
Выращенную культуру стерильно смывают водой с поверхности агаризованной среды в колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащие 50 — 100 мл жидкой питательной среды. Колбы с культурой помещают на качалку, которая находится в термостатируемом помещении (28 — 30°С). Перемешивание культуры, которое осуществляется встряхиванием качалки (120 — 210 об/мин), увеличивает скорость роста культуры благодаря интенсификации
массообмена. Продолжительность выращивания культуры в колбах на качалке составляет 18 — 36 ч. Эту стадию выращивания необходимо контролировать по морфологическим показателями микроорганизма. Наилучшие результаты дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости в конце логарифмической фазы роста.
На второй стадии выращивания посевного материала готовую культуру из колб стерильно переносят в посевной аппарат (инокулятор), в который предварительно вносят питательную среду и минеральные соли в определенных количествах. Посевной аппарат оснащен мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования температуры, рН, уровня пены и т. д. Объем питательной среды в аппарате не должен превышать 60 % общего объема. Важное значение имеет количество внесенного в аппарат посевного материала. При малом количестве посевного материла требуется более длительный период инокуляции. Поэтому в посевной аппарат вносят обычно посевного материала 10 — 12 % от объема питательной среды.
Во время приготовления посевного материала в аппаратах необходимо поддерживать оптимальный режим культивирования. Для контроля регулярно отбирают пробы и проводят их микробиологический и биохимический анализ.
Культивирование продолжают до тех пор, пока в среде не накопится дрожжей или других микроорганизмов 14 — 20 г/л (в расчете на сухую массу). Обычно процесс длится 12 — 14 ч.
Третья стадия культивирования посевного материала осуществляется в посевном аппарате объемом 3,2 м 3 . Для этого все содержимое малого инокулятора перекачивается в аппарат большего объема, в котором находится простерилизованная питательная среда. Коэффициент перехода от одного аппарата к другому зависит от конкретных условий выращивания каждой культуры микроорганизмов. Если этот переход осуществляется в фазе экспоненциального роста, то коэффициент перехода по отношению к объему следующего аппарата равен обычно 10. Процесс выращивания длится 12 — 14 ч.
Четвертая стадия процесса осуществляется в аппарате объемом 50 м 3 . Перед приемом дрожжевой суспензии с предыдущей стадии в аппарате готовят питательную среду путем подачи питательной среды, растворов питательных солей и микроэлементов. Среду доводят до оптимальных значений рН и температуры, перекачивают засевные дрожжи с предыдущей стадии и начинают процесс выращивания при непрерывной аэрации и перемешивании. Процесс накопления дрожжей длится 10 — 12 ч. Когда концентрация абсолютно сухих дрожжей в среде составит 14 — 17 г/л, дрожжевую суспензию можно подавать в производственные ферментеры. Полученный посевной материал подвергают тщательному микробиологическому и биохимическому контролю, так как от его активности и чистоты зависит дальнейший производственный цикл.
В микробиологической технологии требуются большие количества сжатого воздуха или инертного газа как для собственно биосинтеза, так и для вспомогательных операций. По технологическим признакам системы подготовки воздуха можно разделить на 4 группы:
— подготовка и подача воздуха на ферментацию при аэробном культивировании;
— подготовка и подача инертных газов для отвода газообразных продуктов из культуральной жидкости при анаэробном культивировании;
— подготовка и подача транспортного сжатого воздуха для перекачивания суспензий микроорганизмов из одного аппарата в другой и для пневмотранспорта сыпучих продуктов;
— очистка воздуха или смеси газов, отводимых от всех видов технологического оборудования.
Каждая из этих систем имеет свои особенности, но процессы стерилизации связаны общей теоретической основой.
При выращивании аэробных микроорганизмов в глубинных условиях требуется непрерывная подача воздуха в ферментеры. Воздух, подаваемый в ферментер, выполняет несколько функций:
— снабжает микроорганизмы кислородом;
— отводит газообразные продукты обмена;
— отводит теплоту, выделяемую микроорганизмами;
— создает однородность суспензии массы микроорганизмов;
— увеличивает скорость массопередачи и перемешивания жидкой среды.
Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет
Источник
Что такое инокулянты и их применение в сельском хозяйстве
Использование инокулянтов при выращивании бобовых культур является важным технологическим фактором, который позволяет получать более полноценный урожай даже при неблагоприятных погодных условиях.
Каждый кубический сантиметр плодородной почвы содержит миллионы микроорганизмов, часть которых обладает способностью вступать с отдельными видами сельскохозяйственных культур в симбиоз, помогая им лучше усваивать биологический азот. В свою очередь растения снабжают бактерии продуктами, которые необходимы им для нормального роста и развития.
Кроме того, часть полезных микроорганизмов, обитающих в почве, помимо способности фиксировать азот, производят биологически активные вещества, которые способствуют росту и развитию растений, укрепляют их иммунитет и повышают жизнестойкость, помогают противостоять неблагоприятным ситуациям и стрессам.
Что такое инокулянты?
Инокулянты представляют собой биологические препараты, которые содержат в своем составе живые микроорганизмы. Их применение способствует увеличению плодородия почвы и повышает степень доступности макро- и микроэлементов, представляющих для растений высокую ценность.
Такие препараты могут вноситься непосредственно в почву, но чаще всего с их помощью производится предпосевная обработка семян. Этот прием позволяет значительно повысить эффективность работы микроорганизмов, поскольку в этом случае бактерии попадают прямо в зону формирования корневой системы, а не рассредоточены по всему объему почвы.
В зависимости от состава и выполняемых задач, все производимые в настоящее время инокулянты можно разделить на четыре типа:
· Средства биологической защиты растений (биопротравители)
Эта группа препаратов содержит в своем составе полезные бактерии или грибы (существуют также комбинированные средства, включающие и тех, и других). Биоудобрения призваны восстанавливать природный цикл питательных элементов, происходящий в почве, улучшая при этом продуктивность плодородного слоя и повышая в нем количество органических веществ.
Для производства биоудобрений используются симбиотические и ассоциативные азотфиксаторы, а также фосфатмобилизирующие бактерии, повышающие биологическую доступность фосфатов, фитатов, и связанных металлов, включая магний, кальций, железо, цинк и другие микроэлементы.
Эта группа препаратов содержит микроорганизмы, которые синтезируют специальные вещества (фитогормоны), стимулирующие развитие корневой системы и способствующие быстрому набору растениями вегетативной массы.
Существует два типа фитогормонов – природные и синтетические, которые по своей структуре идентичны природным, и также обладают мощной биологической активностью.
Благодаря воздействию фитостимуляторов, внутри растений ускоряется процесс деления клеток, улучшается их рост и развитие, что в конечном итоге оказывает положительное влияние на количественные и качественные показатели выращенной продукции.
3. Микоризные инокулянты
В состав микоризных инокулянтов входят споры микоризообразующих грибов. Попав в благоприятные условия, они начинают развиваться, образуя гифы грибного мицелия, которые формируют разветвленную сеть тонких нитей. Мицелий, соединяясь с корнями растений, образует симбиоз, который получил название «микориза» (в переводе с греческого языка это слово означает «грибокорень»).
Благодаря микоризе, происходит увеличение всасывающей поверхности корневой системы. Соответственно, растения поглощают из почвы большее количество влаги и питательных элементов, включая минеральные соли и в особенности фосфор.
4. Средства биологической защиты растений
Эта группа препаратов предназначена для противодействия фитопатогенным инфекционным заболеваниям. Они применяются в профилактических целях, в первую очередь, для обработки посевного материала.
Биопротравители содержат в своем составе микроорганизмы, которые обладают выраженными антагонистическими характеристиками относительно болезнетворных грибов и бактерий, препятствуя их негативному воздействию на растения.
Препаративные формы инокулянтов и их особенности
Существует три вида инокулянтов:
Сухие препараты производятся на основе природного торфа, который является естественной средой обитания азотфиксирующих бактерий, обеспечивая их высокую жизнеспособность в течение 2-х и более лет.
В свою очередь, торфяные инокулянты подразделяются на два типа:
Эффективность стерильного инокулянта несколько выше (да и стоит он дороже), поскольку азотфиксирующие бактерии, находящиеся в нестерильной среде могут в значительной мере угнетаться.
К минусам применения сухих препаратов можно отнести тот факт, что их использование пневматическими сеялками невозможно. Для этой цели подходит исключительно механический тип посевного оборудования.
Что касается инокулянтов, выпускающихся в жидкой форме, то их основной плюс состоит в более равномерном нанесении азотфиксирующих микроорганизмов на поверхность семян. Кроме того, жидкие препараты совместимы с прилипателями, и в отдельных случаях могут применяться вместе с некоторыми микроудобрениями и определенными видами пестицидов.
Инокулянты, производимые в гелеобразной форме, обычно применяются в качестве прилипателей, поскольку они позволяют производить обработку семян, как минимум, за месяц до начала посевной кампании.
Важным показателем эффективности того или иного инокулянта является количество содержащихся в нем жизнеспособных азотфиксирующих бактерий на единицу массы или объема раствора, которая определяется показателем – титр (происходит от французского слова «titre» – качество, характеристика).
По продуктивности фиксации азота бобовые культуры можно выстроить следующим образом:
Применение инокулянтов позволяет:
1. Повышать урожайность бобовых культур
2. Увеличивать содержание белка в семенах
3. Уменьшать химическую нагрузку на почву и растения
4. Использовать оставшийся в почве азот для развития растений, высеянных после бобовых культур (к примеру, оставшийся после сои азот оказывает благоприятное влияние в течение трех последующих лет)
Кроме того, применение инокулянтов при выращивании бобовых культур позволяет практически полностью избежать использования минеральных азотных удобрений, что значительно снижает объем финансовых вложений.
Главная ценность этих препаратов заключается в их способности значительно улучшать фиксацию азота, что тем самым стимулирует ростовые процессы у растений. Это тем более важно, что аборигенные бактерии, обитающие в почве, могут терять часть своих полезных свойств в результате воздействия неблагоприятных факторов, включая погодные условия (низкие температуры, засуха), воздействие пестицидов и так далее.
Приведем несколько цифр, касающихся экономической эффективности использования инокулянтов. Как показала практика, их применение позволяет добиться повышения урожайности такой культуры как соя на 2,7 ц/га (или 14,1%). При этом более чем в два раза увеличивается количество клубеньков, а их масса возрастает почти в 3,5 раза.
Кроме того, следует учесть и фактор накопления в почве ценных соединений азота, что станет хорошим бонусом для последующих культур в севообороте, и вне сомнений принесет дополнительные дивиденды.
Источник