Подготовка посевного материала
В биотехнологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты (грамположительные бактерии, не образующие спор), бактерии и водоросли в виде чистых и смешанных культур. В традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдается смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных процессов – монокультурам (чистым культурам), выращиваемых в асептических условиях. Большинство используемых сегодня культур получено из природных источников, однако затем эти культуры были улучшены или путем выращивания в условиях, характерных для данного процесса (для повышения выхода биомассы и первичных метаболитов), или с помощью мутагенеза или генетической инженерии (для производства вторичных метаболитов).
Посевным материалом (инокулятом) называют чистую культуру микроорганизма, которую получают путем ее последовательного пересева из пробирки в колбу, а затем в аппараты увеличивающегося объема до количества, необходимого для промышленного производства.
Хранение чистой культуры. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента – ключевая задача любого биотехнологического производства. Культуры микроорганизмов-продуцентов заводы получают из коллекций в пробирках на агаризованных питательных средах или в ампулах. Чистая культура микроорганизма может постоянно или по мере необходимости использоваться в производстве. При длительном хранении чистых культур могут происходить случайные нерегулируемые мутации. Для избежания мутаций следует не только соблюдать правила хранения и поддержания исходной культуры, но и периодически проводить пересев культуры и проверку ее однородности как по морфологическим, так и по физиологическим признакам.
На практике культуры хранят различными способами:
· на косом агаре при низкой температуре (1 – 5 °С) можно хранить культуру 1 – 2 мес;
· замораживание и хранение при температуре ниже – 20 °С позволяет сохранить культуру в течение нескольких месяцев, при условии строгого сохранения температурных режимов хранения;
· на твердых средах под слоем стерильного парафина или минерального масла можно хранить дрожжи, плесневые грибы –менее пригоден этот способ для хранения актиномицетов. Масло предохраняет культуру от высыхания идоступа кислорода;
· на агаре без добавления питательных веществ (допускаются очень незначительные добавки питательных веществ);
· лиофилизирование (культуру замораживают при температуре до – 80 °С (обычно при – 30 °С) и подвергают сублимации в вакууме. При этом происходит сублимация превратившейся в лед свободной воды или воды, непрочно связанной с гидрофильными веществами. Лед переходит из твердого состояния в парообразное, минуя жидкую фазу. Для предохраненияклеток от инактивации используют защитные среды (сыворотка крови, бульон, сахароза, смесь песка и глины и др.). Лиофилизированную чистую культуру в ампулах хранят в течение нескольких лет;
· хранение в стерильной смеси песка и глины заключается в следующем.Нанесенные на эту смесь микроорганизмы или суспензию спор сушат прикомнатной температуре и при такой же температуре хранят в посуде, закрытойватной пробкой.
Приготовление посевного материала состоит из следующих этапов:
1. Получение культуры микроорганизма в микробиологической лаборатории завода.
2. Выращивание микроорганизмов в малом посевном аппарате.
3. Выращивание микроорганизмов в большом посевном аппарате.
4. Накопление культуры микроорганизмов в малом ферментере.
Передачу чистых культур из одного аппарата в другой осуществляют в конце логарифмической фазы роста. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования.
Лабораторная стадия. Перед началом технологического процесса культуру размножают в лаборатории в стерильных условиях при оптимальном составе среды и режиме выращивания (рН, температура, длительность). С поверхности косого агара культуру стерильно переносят в колбы объемом 100 – 200 мл и инкубируют. Длительность каждой стадии выращивания 24 ч. Содержимое колб используют в качестве посевного материала для первого инокулятора цеха чистой культуры.
Иногда для уменьшения опасности заражения инфекцией в инокулятор культуру вносят прямо из пробирок. При этом длительность инокуляции увеличивается.
В производстве антибиотиков часто используют споровый материал. При этом в лабораторных условиях культуру размножают двумя способами:
· культуру продуцента высевают на косой агар, инкубируют до образования спор и смывают их стерильной водой. Суспензию спор снова переносят в свежую агаризированную среду для получения спорового материала второго поколения. Выросшие споры еще раз смывают стерильной водой и суспензию используют для получения первого вегетативного поколения продуцента на жидкой среде;
· культуру продуцента высевают на агаризованную среду для получения спор. Полученную суспензию спор сразу же вносят в колбы с жидкой средой и выращивают их на качалке. Полученный таким образом вегетативный материал продуцента первого поколения используют в качестве посевного материала для второго поколения продуцента в колбах с жидкой средой. Вегетативный материал второго поколения используют для внесения в инокулятор.
Инокуляционная стадия. Дальнейшее размножение посевного материала обычно идет в две стадии: в цехе чистой культуры и в отделе инокуляции.
Для приготовления посевного материала используют полноценную среду, тщательно проверенную различными химическими и микробиологическими методами. Культивирование микроорганизмов на питательной среде основного состава позволяет культуре быстро адаптироваться к окружающим условиям и компонентам питательной среды, при этом происходит активация ферментов, а также синтезируются новые ферментные системы. Количество питательной среды в аппарате не должно превышать 60 % общего объема Продолжительность приготовления посевного материала на этой стадии обычно не превышает 1 сут. Посевной материал для главной ферментации готовят в количестве 5 – 20 % объема используемой питательной среды.
Подготовленный посевной материал направляют на культивирование.
Дата добавления: 2016-10-26 ; просмотров: 8338 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
Источник
ТП.2 Выращивание посевного материала в инокуляторе
Вегетативный посевной мицелий выращивает в иноклуляторе (поз.21), объемом 0,1м 3 .
ТП.2.1 Подготовка инокулятора
С разрешения мастера открывают люк, тщательно промывают внутреннюю поверхность аппарата питьевой водой из шланга, затем набирают воду до покрытия барботёра и, пропуская воздух, проверяют его работу. При равномерном выходе воздуха из барботёра последний считают чистым. В случае если воздух проходит через барботёр неравномерно, проводят чистку отверстий, пропуская через бартёр пар. Промывные воды сливают в промышленную канализацию.
Если предыдущая операция была нестерильна, перед сливом содержимого проводят проверку аппарата на герметичность при давлении воздуха 0,12-0,15 МПа (контроль по прибору PI-29). Массу нагревают до 100-110 0 С (контроль по прибору TIRC – 24-2), подачей острого пара через все коммуникации и выдерживают 30 минут.
Содержимое аппарата, после предварительной убивки, вывозят в специально отведенное место.
В аппарат, подлежащий мойке, заливают небольшое количество воды, загружают едкий натр, до концентрации 3-5%. Доливают воду до люка, аппарат герметично закрывают, нагревают острым паром до 90-100 0 С при работающей мешалке и открытой воздушке. Делают выдержку при этой температуре в течение часа, затем содержимое аппарата охлаждают до температуры 35-45 0 С и передают в другой аппарат (допускается трехкратное использование моющего раствора). После промывают аппарат водой и приступают к его ремонту.
Во время ремонта производят внутренний осмотр аппарата, проверяют крепление трубы барботёра, лопастей и муфт мешалки, заменяют прокладки вентилей входа и выхода, пробоотборника, прокладку люка, проверяют уплотнение вала мешалки.
Выявленные дефекты устраняют, закрывают люк и аппарат проверяют на герметичность при давлении воздуха 0,12-0,15 МПа с помощью мыльного раствора. Проверяют герметичность фланцевых соединений, сварных швов, уплотнений сальников и вала мешалки, посевного штуцера, места уплотнений по резьбе манометра, прокладок крышки аппарата и люка. Давление в аппарате не должно падать в течении 30 минут. Если герметичность не достигнута, выявленные дефекты устраняют и аппарат снова проверяют на герметичность.
Отремонтированный герметичный аппарат стерилизуют острым паром в течении 1-1,5 часов при температуре 130-135 0 С и давлении 0,19-0,22 МПа. Подачу пара ведут через все подводящие трубопроводы: барботёр, пробоотборник и посевную линию. При достижении температуры 125 0 С, начинают стерилизацию посевного штуцера, открыв его на 2-3 оборота, стерилизуют в течении 30 минут. После стерилизации посевной штуцер закрывают. При достижении температуры 130-135 0 С и давления 0,19-0,22 МПа отмечают начало стерилизации и стерилизуют 1-1,5 часа. Первые 30 минут стерилизуют при открытой воздушке (для ее стерилизации), затем вентиль закрывают.
По окончании стерилизации прекращают подачу пара и начинают охлаждать аппарат подачей воды в рубашку. При давлении в аппарате 0,06-0,08 МПа паровое давление меняют на воздушное и приступают к приготовлению питательной среды.
ТП.2.2 Приготовление и стерилизация питательной среды
Цель стадии – получить стерильную охлажденную питательную среду для дальнейшего выращивания инокулюма.
Питательная среда должна иметь обогащенный состав, близкий по составу ферментационной среде, однако компоненты в ней присутствуют в меньшем количестве.
Основная цель – сокращение периода адаптации микроорганизма к условиям окружающей среды и наращивание биомассы культуры.
В питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых строится клетка (элементы-органогены, растворенные в воде соединения – макро- и микроэлементы).
Органическим источником азота является соевая мука и кукурузный экстракт. Азот необходим на синтез белков микроорганизма.
Соевая мука богата аргенином ( до 15,7% аргенина по азоту) и является источником белка, эти белки не могут проходить через клеточную мембрану микроорганизмов. В связи с этим, они гидролизуются внеклеточными протеазами продуцента до олигопептидов и свободных аминокислот. Благодаря наличию систем переноса веществ, они проникают в клетку, где олигопептиды гидролизуются внутриклеточными пептидазами до аминокислот.
На производстве питательную среду, содержащую соевую муку предварительно готовят, суспензию заваривают. Заваривание суспензии проводят для облегчения утилизации соевой муки микроорганизмом, т.е. расщепления её протеолитическими ферментами продуцента. Кроме того, после заваривания соевая мука равномерно (без комочков) распределяется по всему объему аппарата.
Соевая мука является очень пеногенным компонентом, вызывая сильно вспенивание культуральной жидкости в процессе культивирования. В процессе заваривания, белки соевой муки частично денатурируются, что уменьшает способность её к пенообразованию.
Адеканоль — синтетический пеногаситель. Его добавляют в среду для предотвращения пенообразования.
Кукурузный экстракт – это густая, непрозрачная, однородная жидкая масса от светло-желтого до темно-коричневого цвета. Кукурузный экстракт – это побочный продукт кукурузно-паточного производства. Он является источником азотного питания, содержит относительно небольшое количество белковых соединений и большое количество свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов. Именно это определяет особую питательную ценность кукурузного экстракта, так как в аминокислотах азот находится в восстановленной форме, то есть в той форме, которая легко ассимилируется микроорганизмами. Также в состав кукурузного экстракта входит зола ( 20-24%). Основной компонент золы является фосфор, калий и магний, причем общее содержание фосфора достигает 5%. Кукурузный экстракт обладает буферными свойствами (определенная устойчивость концентрации ионов водорода, которая мало изменяется при добавлении небольших количествах сильных кислот и щелочей). В его составе присутствуют аминокислоты и органические кислоты, что придает ему в зависимости от содержания этих веществ – основные или кислотные свойства (группировки NH2 – и –COOH). В связи с этим, при приготовлении питательной среды кукурузный экстракт нагревают с мелом. При этом протекают реакции нейтрализации кислот, и кукурузный экстракт теряет свою буферность, что в дальнейшем позволяет установить в питательной среде необходимое значение pH.
Кукурузную муку получают при размалывании зерен кукурузы. Она содержит: крахмал – 67-70%, другие углеводы (клетчатка,пентазаны, декстрины, растворимые углеводы) – 10%; белки – 12%; зольность – 0,9%; влажность не выше 15%.
Питательную среду для выращивания культуры, готовят в смесителе (поз.6).
В аппарат через люк при работающей мешалке загружают питьевую воду, добавляют навеску кукурузной муки, взвесив на весах WI-1 (поз.1), нагревают глухим паром до температуры 70-88 0 С. И при этой температуре разваривают муку в течении 30 минут при включенной мешалке.
Затем добавляют навески мела, соли предварительно разведённые водой и тщательно перемешанные. В смеситель также поступает кукурузный экстракт из сборника (поз.4) при помощи насоса (поз.8). Доводят рН до 6,9-7,1 40% раствором щелочи (контроль по прибору QI – 12-2), который насосом (поз.15) передается из сборника (поз.11). Затем через люк загружают пеногаситель адеканоль.
При непрерывно работающей мешалке приготовленную питательную среду по трубопроводу, предварительно отработанному паром, центробежным насосом (поз.12) передают в инокулятор (поз.21) объем 0,1 м 3 . Перед насосом (поз.12) стоит мембранный фильтр (поз.10), состоящий из нержавеющей металлической сетки. Он служит для механического удаления комочков в питательной среде. Комочки необходимо удалять для того, чтобы стерилизация среды была эффективная, так как в центре комочка могут не погибнуть микроорганизмы и вероятен риск контаминации.
После передачи питательной среды в инокулятор при закрытой воздушке открывают вентиль подачи воздуха на барботёр. При достижении воздушного давления 0,12-0,15 МПа (контроль по прибору PI-14) вентиль подачи воздуха на барботёр перекрывают.
При наборе давления, во избежание попадания среды из инокулятора в индивидуальный фильтр (поз.22), строго соблюдается положение: давление в индивидуальном фильтре на 0,02-0,04 МПа выше, чем на аппарате.
При достижении воздушного давления на аппарате 0,12-0.15 МПа проверяют на герметичность прокладки люка (с помощью мыльного раствора). По окончании проверки люка снимают с аппарата давления, закрывают смотровые стёкла, надевают колпачок на пробоотборник.
При давлении на паровой магистрали 0,25-0,3 МПа, при работающей мешалке, после предварительного спуска воды и конденсата из рубашки, подают острый пар в аппарат: через посевную линии, барботёр и пробоотборник.
При температуре 105 0 С прикрывают воздушку, оставляя ее открытой на 0,5-1 оборот, при температуре 115-117 0 С начинают стерилизацию посевного штуцера, открыв его на 1,5-2 оборота и стерилизуют его в течение 30 минут.
При достижении температуры 127-129 0 С и давлении 0,15-0,17 МПа отмечают начало стерилизации и стерилизуют аппарат со средой в течение одного часа при постоянно работающей мешалке. По окончании стерилизации среды прекращают подачу острого пара в аппарат и начинают охлаждение питательной среды путём подачи захоложенной воды в рубашку аппарата при работающей мешалке.
При снижении давления пара до 0,06-0,08 МПа меняют паровое давление на воздушное. Охлаждение среды ведут до температуры 26-28 0 С, при этом давление в аппарате поддерживают стерильным сжатым воздухом в пределах 0,05-0,06 МПа.
Перед посевом после 30 минутной пропарки пробника, в зоне огня (соблюдая асептику), отбирают пробу среды для определения биохимического состава, рН и стерильности. После отбора проб пробник оставляют на пропарке.
Питательная среда должна иметь следующий биохимический состав:
Результаты анализа записываются в микробиологическом журнале.
ТП.2.3 Засев питательной среды и выращивание вегетативного мицелия в инокуляторе
Простерилизованную питательную среду, охлаждённую до 26-28 0 С, засевают мицелием из колб или суспензией спор из колбы посевной культуры Str. Levoris штамм 78.
Посев производится при минимальном движении воздуха в помещении, для чего за 15 минут до посева закрывают окна, двери, прекращают хождения, выключают вентиляцию. Обрабатывают 1% раствором формалина или хлорамина посевной штуцер и прилегающий к нему на крышке аппарата коммуникации. Вокруг посевного штуцера создают зону пламени при помощи горящего кольцевого факела, смоченного этиловым спиртом.
Прекращают подачу воздуха в аппарат, при снижении давления в аппарате до 0, МПа снимают колпачок с посевного штуцера (колпачок в течение всего посева держат в зоне пламени).
В зоне пламени факела снимают ватно-марлевую пробку, обжигают края колбы и содержимое колбы выливают через посевной штуцер в инокулятор, после чего колпачок закрывают.
Открывают вентиль входа воздуха в барботёр (контроль по прибору FI – 26-2), и устанавливают в аппарате давление 0,03-0,05 МПа. Горящий факел переносят к пробнику, прекращают пропарку и отбирают пробу среды после посева на отсутствии посторонней микрофлоры и рН. Затем открывают полностью вентиль подачи стерильного воздуха в барботёр и , регулируя вентиль на воздушке, устанавливают давление в аппарате 0,03-0,05 МПа.
Температуру во время выращивания поддерживают 26-28 0 С (контроль по прибору TIRC – 24-2), избыточное давление в аппарате 0,03-0,05 МПа. Количество подаваемого воздуха 0,5-0,8 объёма на объём среды в аппарате. Перемешивание мешалкой непрерывное. Температура подаваемого воздуха 50-55 О С, время выращивания 36-50 часов. Указанные параметры каждый час записываются в микробиологический журнал.
В случае вспенивания добавляют стерильный адеконоль, непосредственно в аппарат через посевной штуцер в зоне пламени кольцевого факела.
Из аппарата асептично через каждые 6 часов отбирают пробы для контроля за стадиями развития гриба, стерильностью, рН (контроль по прибору QI – 27-2), результаты анализа записываются.
Посевной мицелий к моменту передачи его в аппарат должен удовлетворять следующим требованиям:
-по внешнему виду должен представлять собой густую хлопьевидную массу, заполняющую не менее 1/3 объёма пробы;
-в высевах из исходной посевной колбы питательной среды и всех проб из инокулятора должна отсутствовать посторонняя микрофлора, а также должно быть установлено отсутствие посторонней микрофлоры при микроскопическом исследовании перед посевом;
-при исследовании под микроскопом окрашенного препарата мицелий должен иметь редкое сплетение микроколоний образованное длинными ветвящимися гифами второй стадии развития, протоплазма гиф гомогенна, базофильна.
Перед передачей в посевной аппарат допускается захолаживание посевного мицелия до температуры 18 0 С и хранение его не более 10 часов.
Посевной материал, не отвечающий требованиям, для посева не используют.
Источник