Как определить коли титр почвы
Санитарно-бактериологическое исследование почвы — Н. А. Бельская
Почва является основным местом обитания многих микроорганизмов (см. главу 6). Из почвы микробы поступают в воду и обсеменяют воздух.
Микробиологическое исследование почвы имеет важное значение. Оно проводится при выборе участка для строительства детских учреждений, спортивных площадок, больниц, госпиталей, военных лагерей, водопроводных сооружений и других объектов.
Санитарно-микробиологический анализ почвы включает определение:
1) общего количества бактерий в 1 г почвы;
2) титра санитарно-показательных микроорганизмов БГКП и С. perfringens;
3) термофильных бактерий в 1 г почвы;
4) по эпидемиологическим показаниям проводится исследование на наличие патогенных микроорганизмов (сальмонелл, шигелл, клостридий столбняка, ботулизма, некоторых вирусов и др.).
Отбор проб почвы. Выбор места для отбора проб почвы определяется санитарным врачом и бактериологом в зависимости от цели и задачи исследования. На обследуемой территории до 1000 м 2 выделяют два участка площадью 25 м 2 . Один должен быть расположен близ источников загрязнения (свалки, мусорные ящики, выгребные ямы и т. д.), другой — в отдалении от них (контроль). На каждом участке в 25 м 2 намечают для отбора проб пять точек: четыре по углам и одна в центре или пять точек по диагонали участка.
Для исследования поверхностного слоя почвы пробы отбирают стерильной лопаткой или совком на глубине до 20 см. Из отдельных точек участка лопаткой выкапывают цельный кусок почвы. Стерильным ножом снимают верхний слой толщиной 1,5-2,0 см и из середины куска набирают стерильной ложкой 200-300 г почвы. Смешанный образец, составленный из пяти отдельно взятых проб почвы, должен весить не менее 1 кг.
При исследовании образцов из глубинных слоев почвы (от 0,75 до 2 м) пользуются специальным буром с полостью. На заданной глубине полость бура открывается, наполняется почвой, затем механически закрывается, и бур извлекают на поверхность.
Пробы почвы, взятые для анализа, переносят в стерильные банки с ватно-марлевыми пробками и покрывают стерильной пергаментной бумагой. К каждой банке приклеивают этикетку с указанием даты и номера пробы. В сопроводительном документе отмечают характер почвы, расположение источников загрязнения, площадь обследуемой территории, данные, характеризующие климат местности и т. п.
Все пробы помещают в деревянный ящик с гнездами и немедленно транспортируют в лабораторию. Если нет возможности приступить к исследованию почвы в тот же день, то допускается хранение проб в холодильнике при 1-2° С в течение суток.
Подготовка проб почвы к исследованию. Образцы почвы, отобранные на одном участке из нескольких точек, хорошо перемешивают, освобождают от крупных включений (щебня, камней, корней, стекол). От среднего образца отделяют 200-300 г и вносят в стерильную посуду. Затем почву дробят в стерильной ступке, просеивают через стерильное сито на стерильную бумагу и берут для исследования навеску в 30 г. Навеску почвы высыпают в стерильную колбу вместимостью 500 мл и доливают 270 мл стерильной водопроводной воды, получают разведение почвы 1:10. Взбалтывают почвенную взвесь 10-15 мин и из приготовленного разведения 1:10 без отстаивания готовят ряд последовательных десятикратных разведений по общепринятой методике. При анализе чистых почв ограничиваются 3-4 разведениями (до 1:1000, 1:10000), при исследовании загрязненных почв используют разведения — до 1:100000, 1:1000000.
Определение общего количества бактерий в почве проводят аналогично исследованию воды. Показатели общего количества бактерий для различных видов почв представлены в табл. 55.
Определение БГКП как показателя фекального загрязнения проводят двумя методами: титрационным и методом мембранных фильтров.
Из первоначального разведения почвенной взвеси 1:10 стерильной пипеткой берут 10 мл, что соответствует 1 г почвы, и засевают во флаконы с 50 мл среды Кесслер. Затем из каждого разведения почвы засевают по 1 мл в пробирки с поплавками, содержащими 9 мл той же среды. Посевы выращивают в термостате 24 ч при 37° С.
Просматривают посевы (при задержке роста посевы оставляют на третьи сутки). Отсутствие газообразования и помутнения в бродильных сосудах со средой Кесслер через 48 ч позволяет дать отрицательный ответ.
При наличии в средах газообразования и помутнения или только помутнения из этих сосудов производят высев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.
Просматривают посевы. Отсутствие роста на среде Эндо дает право на отрицательный ответ.
Если на среде Эндо вырастают типичные для кишечной палочки колонии, то из них делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба на оксидазу отрицательная, то проверяют ферментативные свойства выделенной культуры путем посева на полужидкую среду с глюкозой. Посевы помещают в термостат на 24 ч при 37° С.
Просматривают посевы. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие кишечной палочки в исследуемом разведении почвы.
Коли-титр почвы определяют по наименьшему объему, в котором обнаруживают БГКП (показатели коли-титра для различных видов почв представлены в табл. 55).
Таблица 55. Схема оценки санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям
Метод мембранных фильтров применяют при исследовании малозагрязненных почв. Через стерильные мембранные фильтры № 3 пропускают по 10 мл почвенной взвеси из разведений 1:10, 1:100, 1:1000. Дальнейший ход исследования аналогичен определению кишечных палочек в воде. Метод мембранных фильтров позволяет сократить срок исследования до двух суток. Результаты анализа выражают коли-индексом. Коли-индекс почвы — это количество кишечных палочек в 1 г почвы.
Примечание. Среда Кесслер содержит лактозу, которую сбраживают БГКП, и генциановый фиолетовый, задерживающий рост грамположительной микрофлоры.
Из всех приготовленных почвенных разведений (от 1:10 до 1:1000000) по 1 мл вносят в два параллельных ряда стерильных пробирок. Один ряд пробирок прогревают при 80° С 15 мин для освобождения от неспороносной микрофлоры. Затем во все пробирки наливают по 9 мл расплавленной и остуженной до 45° С среды Вильсона — Блера, приготовленной ex tempore. Пробирки вращают между ладонями, чтобы посевной материал равномерно распределился в питательной среде, и быстро опускают их в холодную воду для удаления кислорода и охлаждения среды. Посевы выращивают при 43° С 24 ч.
C. perfringens дает рост в глубине среды в виде черных колоний. Газообразование регистрируется по разрыву питательной среды. В мазках, приготовленных из колоний, обнаруживают грамположительные крупные палочки со спорами овальной формы, расположенные центрально или субтерминально.
Предельное разведение почвенной взвеси, которое дает на среде Вильсона — Блера рост C. perfringens, означает титр этого микроба в почве (см. табл. 55). Наличие в почве C. perfringens является косвенным показателем присутствия в ней и других клостридий — возбудителя столбняка (C. tetani), возбудителя ботулизма (C. botulinum).
В почве определяют также количество термофильных бактерий в 1 г. Почва, в которой много кишечных палочек и мало термофилов, может рассматриваться как загрязненная фекалиями.
Среда Кесслер. К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят 20-30 мин, фильтруют через вату, прибавляют 10 г лактозы и доводят объем до 1 л. Устанавливают рН 7,4-7,6. Добавляют 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового. Среду разливают в колбы и пробирки с поплавками. Стерилизуют 15 мин при давлении 0,5 атм (112° С). Среда имеет фиолетовый цвет.
Контрольные вопросы
1. В каких случаях проводят санитарно-бактериологическое исследование почвы?
2. Какие определения включают санитарно-бактериологический анализ почвы?
3. Как проводят отбор проб почвы?
4. Какими методами определяют наличие БГКП в почве?
Задания
1. Приготовьте из почвенной взвеси в разведении 1:10 ряд последовательных разведений 1:100, 1:1000,1:10000 и проведите определение микробного числа в данной пробе почвы.
2. Возьмите у преподавателя готовые посевы разведений почвы на среде Вильсона — Блера, определите титр C. perfringens. Сделайте мазки из колоний, окрасьте по Граму. Найдите под микроскопом в мазках C. perfringens и покажите преподавателю. Результаты микроскопии зарисуйте в тетрадь.
Источник
ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I — Л. В. Красникова — 2016
13. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЧВЫ
Цель работы: провести микробиологическое исследование почвы как источника контаминации пищевых продуктов посторонними микроорганизмами.
Почва обильно заселена микроорганизмами. В ней встречаются все формы микроорганизмов, которые существуют на Земле: бактерии, вирусы, актиномицеты, дрожжи, грибы, простейшие. Общее микробное число (ОМЧ) в 1 г почвы может достигать от 1,0 до 10 млрд. В разных слоях почвы количество микроорганизмов неодинаково. В самом верхнем слое (0,5 см) микроорганизмов очень мало. На глубине от 1-5 см до 30-40 см число микроорганизмов максимально — в среднем от 10 до 50 млн в 1 г. После 30-40 см глубины ОМЧ постепенно снижается и в более глубоких слоях оно минимально.
Микрофлору почвы делят на 2 группы:
1) аутотрофная — питается минеральными веществами;
2) гетеротрофная — питается органическими веществами.
Обе группы участвуют в процессах самоочищения почв, их минерализации. Однако в группе гетеротрофных микроорганизмов может присутствовать патогенная микрофлора. При загрязнении почвы фекалиями людей, больных кишечными инфекциями, продукты растительного происхождения могут быть контаминированы возбудителями дизентерии, холеры, брюшного тифа, сальмонеллеза, энтеровирусами. Установлена прямая зависимость между уровнем заболеваемости человека и животных кишечными инфекциями и неудовлетворительным санитарным состоянием почвы. Через почву передаются возбудители таких инфекционных заболеваний, как сибирская язва, газовая гангрена, столбняк и др.
При санитарно-микробиологическом анализе почвы определяют общее микробное число, колититр, перфрингенс-титр, титр нитрифицирующих бактерий и количество протеев и термофильных бактерий. Микробное число характеризует загрязненность почвы органическими веществами. Присутствие в почве бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о ее фекальном загрязнении. Обнаружение в почве палочки Clostridium perfringens также указывает на ее фекальное загрязнение. Наличие в почве бактерий рода Proteus дает основание считать возможным загрязнение почвы органическими веществами животного происхождения или фекалиями человека. Присутствие термофильных микроорганизмов указывает на загрязнение почвы навозом или компостами. В чистых почвах термофильные микроорганизмы, как правило, не обнаруживаются.
Взятие проб почвы. При проведении микробиологических исследований поверхностных слоев почвы образцы берут на глубине 15-20 см, снимая верхний слой толщиной 2 см (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб). Отбирают пробы маленькой железной лопаткой или совком в стерильные широкогорлые банки, завернутые в бумагу и снабженные этикеткой. Каждый взятый образец должен весить 200-300 г, а смешанный образец (средняя проба) — не менее 1 кг.
Подготовка почвы для анализа. Образцы почвы освобождают от крупных включений, размельчают, просеивают через стерильное 3-миллиметровое сито, затем пробу почвы высыпают на стерильную бумагу, тщательно перемешивают и отвешивают 10 г. Навеску почвы помещают в колбу емкостью 250 см с 90 см стерильной водопроводной воды. Получают разведение 1:10, которое соответствует 0,1 г исследуемой почвы. Колбу встряхивают в течение 10 мин, дают отстояться грубым частицам почвы в течение 30 с и затем делают от 3 до 6 десятикратных разведений в зависимости от загрязненности почвы.
13.1. Определение микробного числа почвы
В две стерильные чашки Петри, слегка приоткрыв крышку, вносят по 1 см 3 10 -4 и 10 -5 разведений почвенной суспензии и затем заливают их расплавленным и охлажденным до 45 °С питательным агаром (МПА или картофельно-глюкозный агар). После застывания агара чашки помещают в термостат на 24-48 ч при температуре 37±2 °С, а затем выдерживают столько же при комнатной температуре. Подсчитывают число выросших на чашках колоний и определяют микробное число в 1 г почвы с учетом засеянного разведения.
13.2. Определение колититра почвы
Наличие бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о свежем фекальном загрязнении почвы. Титром кишечной палочки (колититр) называют наименьшее количество почвы (в г), в котором обнаруживаются кишечные палочки. Колииндексом почвы называют количество кишечных палочек в 1 г почвы.
Для определения колититра по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -5 засевают в пробирки со средой Кесслера, в которых находятся поплавки. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 ч, после чего отмечают накопление газа в поплавках.
13.3. Определение перфрингенс-титра почвы
Перфрингенс-титр — титр грамположительных облигатноанаэробных спорообразующих палочек, восстанавливающих сульфиты. Присутствие С. perfringens (споровых форм) свидетельствует о давнем фекальном загрязнении.
Для определения перфрингенс-титра используют железосульфитный агар (среда Вильсона-Блера). Обнаружение С. perfringens на этой среде основано на способности данного микроорганизма восстанавливать Na2S2O3 до Na2S, который, взаимодействуя с хлорным железом, приводит к образованию сернистого железа (FeS), имеющего черный цвет.
Пробирки с разведениями почвенной суспензии прогревают на водяной бане с температурой 80-85 °С в течение 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и засевают по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -4 в пробирки с расплавленной и охлажденной до 45 °С средой Вильсона-Блера. Вращением пробирки между ладонями почвенную суспензию равномерно распределяют в среде, после чего пробирки охлаждают в проточной водопроводной воде до застывания агара. Посевы инкубируют в течение 18-24 ч при температуре 43 °С. О наличии С. perfringens судят по росту черных колоний в пробирках со средой.
13.4. Определение количества термофильных микроорганизмов в почве
Для определения индекса термофильных бактерий в стерильные чашки Петри вносят по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -3 , заливают их расплавленным и охлажденным до 45 °С МПА. После застывания агара чашки инкубируют в течение 24 ч при температуре 60 °С, после чего подсчитывают число выросших колоний и определяют количество термофильных бактерий в 1 г почвы с учетом разведения.
13.5. Обнаружение в почве палочек протея
Бактерии рода Proteus попадают из почвы на пищевые продукты и при благоприятных условиях размножаются в них. Продукты жизнедеятельности палочек протея могут вызвать пищевое отравление.
Для обнаружения в почве палочек протея по методу Шукевича в конденсационную воду свежескошенного МПА вносят 0,1 см 3 соответствующего разведения почвенной суспензии. Пробирки выдерживают в течение 24-48 ч в термостате при температуре 37 °С, после чего регистрируют рост протеев по образованию тонкой вуалевидной пленки на скошенной поверхности агара. При наличии такой пленки готовят микроскопический препарат с ее поверхности, окрашивают его по Граму, определяют подвижность и способность образовывать H2S.
Результаты санитарно-микробиологического исследования почвы анализируют и дают ей оценку, пользуясь данными, приведенными в табл. 13.1.
Таблица 13.1. Схема оценки санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям
Источник