Метод биотестирования токсичности почвы
Определение интегральной токсичности почв с помощью биотеста «Эколюм»
1. Методические рекомендации разработаны: ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (Ревазова Ю.А., Донерьян Л.Г.), Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова (Данилов B.C.), ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора (Брагина И.В, Ластенко Н.С., Федосеева Т.А).
2. С выходом настоящих методических рекомендаций утрачивают силу методические рекомендации «Определение общей токсичности почв с помощью бактериального теста «Эколюм» от 8 июня 2000 г. МР N 11-134-09.
УТВЕРЖДЕНЫ Главным врачом ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека», Председателем Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И.Верещагиным 15 июня 2007 г.
1. Назначение и область применения
Настоящий документ устанавливает методику быстрого и количественного контроля степени интегральной химической токсичности водных вытяжек из почвы. Тест-система представлена биосенсорами серии «Эколюм» и измерительным прибором серии «Биотокс-10». Тест-система реагирует на токсичные соединения разнообразной химической природы и смеси веществ.
Документ предназначен для учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор.
Опасность загрязнения почв определяется уровнем ее возможного отрицательного влияния на контактирующие среды (вода, воздух), пищевые продукты и прямо или косвенно на человека.
Результаты обследования учитывают при определении и прогнозе степени опасности почв для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах, разработке мероприятий по их рекультивации, технических решений по реабилитации и охране территорий, оценке эффективности санитарно-экологических мероприятий и текущего санитарно-эпидемиологического надзора за объектами, воздействующими на окружающую среду населенного пункта.
2. Нормативные ссылки
3. ГОСТ 27793-88* (СТ СЭВ 5298-85) «Почвы. Термины и определения».
_______________
* Вероятно ошибка оригинала. Следует читать ГОСТ 25793-88, здесь и далее по тексту. — Примечание изготовителя базы данных.
4. ГОСТ 17.2.2.01-81* (СТ СЭВ 4470-84) «Охрана природы. Почвы. Номенклатура показателей санитарного состояния».
* Вероятно ошибка оригинала. Следует читать ГОСТ 17.4.2.01-81 , здесь и далее по тексту. — Примечание изготовителя базы данных.
5. ГОСТ 17.4.3.01-83 «Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб».
6. ГОСТ 17.4.3.03-85 «Охрана природы. Почвы. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ».
7. ГОСТ 17.4.4.02-84 «Охрана природы. Почва. Методы отбора и подготовки проб почвы для химического, бактериологического и гельминтологического анализа».
8. ГОСТ 17.4.3.06-86 (СТ СЭВ 5101-85) «Охрана природы. Почвы. Общие требования к классификации почв по влиянию на них химических загрязняющих веществ».
3. Термины и определения
Санитарно-гигиенический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением гигиенических нормативов качества окружающей среды.
Химическое загрязнение почвы — изменение химического состава почвы, возникшее под прямым или косвенным воздействием антропогенного фактора (промышленного, сельскохозяйственного, коммунального и т.п.), вызывающее снижение ее качества и возможную опасность для здоровья человека.
Фоновые почвы — почвы территорий, не подвергающихся техногенному воздействию или испытывающих его в минимальной степени.
Токсичность — степень проявления вредного действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность — один из важных факторов, определяющих качество окружающей среды, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности объектов при их использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе.
Критерий токсичности (индекс токсичности) — достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности изучаемого объекта. Среди тест-параметров наиболее часто используют выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.
Тест-реакция — это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или другого функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.
Биотестирование — проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.
Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемом объекте, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.
Биолюминесценция — интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.
4. Принцип методики
Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции биосенсора при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.
При изучении токсикологических свойств объектов окружающей среды люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на животных, культуры клеток человека и другие известные биотесты.
Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с контролем. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.
5. Количественная оценка параметров тест-реакции
Токсическое действие исследуемой пробы на тест-объект определяется по уменьшению интенсивности биолюминесценции за 30-ти минутный (в экспрессном варианте — 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины — индекса токсичности » » и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.
Индекс токсичности » «, равный отношению 
, где и соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с биосенсором.
Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения и , позволяют быстро и экономно выяснить вопрос при каких объемах исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее ЕС20).
ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением — концентрация), вызывающий тушение свечения биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс токсичности равен 50). ЕС20 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением — концентрация), который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец имеет допустимую степень токсичности.
Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция (G) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой 
, где и соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец сильно токсичен. График -функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте.
Люминометр «Биотокс-10» автоматически вычисляет величину индекса токсичности и параметры ЕС20 и ЕС50.
Методика предусматривает три пороговых уровня индекса токсичности:
— допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности меньше 20; объем пробы или концентрация вещества в пробе меньше величины ЕС20;
— образец токсичен: индекс равен или больше 20 и меньше 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) меньше величины ЕС50 и больше или равен ЕС20;
— острая токсичность образца: индекс токсичности равен или более 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) равен или больше величины ЕС50.
6. Оборудование, материалы, реактивы
1. Лиофилизированный биосенсор «Эколюм», ТУ 2639-236-00209792-01;
2. Прибор серии «Биотокс-10», сертификат об утверждении типа средств измерений RU.C.31,003.A N 21703, с набором кювет для измерения биолюминесценции объемом 1,5 мл;
3. Весы лабораторные общего назначения. ГОСТ 24104;
4. рН-метр, ГОСТ 25.7416.0171 или аналоги;
5. Термометр лабораторный 0-55 °С, цена деления шкалы — 0,5 °С, ГОСТ 215;
6. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474;
7. Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-18±1 °С) и хранение проб (2-4 °С);
8. Часы сигнальные, ТУ 25-07-57;
9. Подставка (из пластика, дерева) с углублением для пенициллиновых пузырьков или измерительных кювет, на которой можно разместить не менее 12 кювет;
10. Буры почвенные, ножи почвенные, ГОСТ 2307;
12. Бумажные фильтры обеззоленные типа ФОБ (красная, белая ленты), ТУ 6-09-1678;
13. Пипетки автоматические дозаторы любого типа объемом 0,02-0,5 мл ±1,0%;
14. Цилиндры вместимостью 25, 50 мл второго класса точности, ГОСТ 1770;
15. Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 10, 50 мл, ГОСТ 25336;
16. Пипетки объемом 0,5 и 1,0 мл, ГОСТ 29227;
17. Пробоотборник любого типа, объемом не менее 5 мл;
18. Флаконы и банки стеклянные с навинчивающейся крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 10, 50, 100 мл;
19. Воронки лабораторные, ГОСТ 25336;
20. Стаканчики для взвешивания (бюксы) диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148;
Источник
Метод биотестирования токсичности почвы
Биотестирование грунта проводят с целью определения содержания токсичности взятых образцов. Это процедура мониторинга состояния почвы, воды и других составляющих экосистемы востребована для различных отраслей народного хозяйства. Методика биотестирования почвы выполняется для определённой культуры организмов в лабораторном эксперименте методом моделирования ситуации, происходящей в реальной экосистеме.
Основная сложность биотестирования почвы заключается в том, что токсичные отходы многообразны и нестабильны. Сегодня число только известных соединений, загрязняющих среду, превысило миллион позиций, при этом ежегодно это количество возрастает примерно на 250 000 наименований. В природной среде эти вещества взаимодействуют друг с другом, образуя новые комплексы, токсичность которых может быть выше исходных компонентов—загрязнителей.
Методика биотестирования почвы должна быть разработана таким образом, чтобы максимально точно исследовать существующую ситуацию в экосистеме.
Особенности биотестирования грунтов и донных отложений
Почва — неоднородная система. Этот объект для анализа состоит из четырёх фаз (твёрдой, жидкой, газообразной и биотической). Такое строение отличает её от других сред, затрудняя нормирование содержания загрязняющих компонентов.
На биотестирование проб грунта также влияет и климатический фактор, поскольку в зависимости от сезона и установившихся температур активность разных групп бактерий может довольно сильно меняться.
Тем не менее, методики биотестирования грунта и донных отложений приобретают всё большую актуальность и повсеместно применяются для анализа по ряду причин:
• Почвы— многокомпонентные системы с большим количеством включённых в состав соединений, токсичность которых не всегда равна их сумме.
• Объект исследований может быть загрязнён неустойчивыми продуктами, взаимодействующими между собой с изменением уровня токсичности.
• Количество загрязняющих компонентов, их физико—химическое разнообразие значительно превышает число аналитических методов исследования.
Именно по этим причинам биотестирование проб грунта даёт возможность определить интегральную токсикологическую характеристику образцов без учёта детального состава загрязняющих компонентов.
Биотестирование донных отложений как один из вариантов анализа проб грунтов выполняется при оценке уровня загрязнений водоёмов с целью обеспечения безопасной хозяйственной деятельности предприятий, строительных компаний.
Образцы грунта для исследования
Задачи биотестирования грунта
Методы биотестирования почвы сегодня являются единственным типом анализа, который позволяет определить уровень загрязнения экосистемы. Исследование проводится с помощью групп тестовых организмов, призванных обеспечить следующие параметры:
• Скорость и экономическую целесообразность исследования.
• Высокую чувствительность тестовых организмов к небольшим дозам токсических соединений.
• Достоверную экстраполяцию. Данные смоделированного в лаборатории процесса должны быть легко перенесены в реальную экосистему.
Биотестирование почвы с помощью тестовых организмов позволяет игнорировать детальный состав поллютантов и их комбинаций в экосистеме, и при этом дать достоверную оценку степени токсичности. Заключение о потенциальной опасности распространяется как на группу загрязняющих веществ, так и на продукты их метаболизма.
В качестве тестовых объектов могут быть взяты бактерии, простейшие водоросли, культуры дрожжей, пиявки и др., а также отдельные органы или клетки. В ходе анализа фиксируются морфологические нарушения, отмечается время гибели организмов, отклонения в поведении, перемена в двигательной активности и другие функциональные изменения. По совокупности результатов определяется уровень токсичности исследуемого образца.
Экоаналитическая лаборатория Регионлаб
Компания Регионлаб проводит биотестирование проб грунта, почвы и донных отложений в СПб и области с использованием передовых методик, что позволяет заказчикам получить достоверные сведения о токсичности проб в кратчайшие сроки и по оптимальным ценам.
Для расчёта стоимости анализа позвоните нашим специалистам — мы поможем принять правильное решение.
Экологическая безопасность почвы — наша общая ответственность.
Источник