Методика приготовления питательных сред для выращивания микроорганизмов

Приготовление питательных сред

В процессе микробиологического исследования выделяют чистые культуры микроорганизмов, осуществляют их культивирование с последующим изучением свойств. Культуры, состоящие из микроорганизмов одного вида, называют чистыми. Их используют при проведении диагностических мероприятий в процессе выявления инфекционных заболеваний, определяя видовую и типовую принадлежность.

Культивирование микроорганизмов осуществляется с помощью специальных субстратов – питательных сред. Среды для культивирования, выращиваемые в искусственных условиях, позволяют отследить все процессы микроорганизмов – питание, дыхание и размножение.

Особенности питательных сред, используемых для культивирования

От качества питательной среды зависят результаты исследования. Для создания оптимальных условия для жизнедеятельности микробов, среды должны соответствовать определенным параметрам:

• Питательность. В их составе должны присутствовать все необходимые вещества, обеспечивающие легкую усваиваемость, а также удовлетворение потребностей в пище и энергии. В некоторых случаях в состав питательных сред специально добавляют витамины и аминокислоты, обеспечивающие необходимый рост клеток.
• Оптимальная концентрация водородных ионов. Для обеспечения необходимой проницаемости оболочки клеток.
• Изотоничность. Для поддержания осмотического давления в среде в соответствии с давлением внутри клетки.
• Стерильность. Для исключения посторонних микробов, которые могут препятствовать росту.
• Оптимальная консистенция.
• Окислительно-восстановительный потенциал.
• Унифицированность. Обеспечивает содержание постоянного количества ингредиентов.

Для удобства слежения за ростом культивируемых культур, среда должна быть прозрачной.

Питательные среды можно классифицировать по нескольким параметрам:

• Компонентный состав. По этому критерию среды делят на натуральные и синтетические. Для натуральных используют продукты животного и растительного происхождения. Для приготовления синтетических сред используют органические и неорганические соединения химически чистого типа.
• Уровень плотности. По консистенции среды делятся на жидкие, плотные и полужидкие. Для получения необходимой плотности используют агар-агар или желатин.
• Состав. По этому критерию среды делятся на простые и сложные.
• Назначение. Среды делятся на общеупотребительные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие.

Особенности состава питательных сред для культивирования

Основные компоненты любой питательной среды – соединения углерода и азота. На натуральных средах хорошо растут и развиваются многие микроорганизмы, так как они содержат большое количество необходимых ингредиентов. Но их редко используют для изучения физиологии обмена веществ, так как их состав сложен и непостоянен. Для этого удобнее и информативнее использовать синтетические среды.

Приготовление питательных сред

При приготовлении сред следует использовать строго чистую посуду, которая не содержит посторонних веществ – щелочей или окислов, а также ржавчины. Оптимально использовать эмалированные, стеклянные или алюминиевые емкости. При необходимости приготовления больших объемов сред используют специальные варочные котлы или реакторы. Перед началом приготовления посуду тщательно моют, вытирают и просушивают. Стеклянные емкости предварительно необходимо прокипятить в хлор водородной кислоте.

Важно! Посуду для приготовления питательных сред запрещено использовать для других целей.

Основные компоненты большинства питательных сред – это продукты животного и растительного происхождения. Для приготовления питательных бульонов используют мясную воду или перевары от кислотного или ферментативного гидролиза. Чаще всего используют панкреатический перевар Хоттингера, гидролизаты казеина и кормовые дрожжи. На их основе готовят различные среды.

Этапы приготовления питательных сред

Процесс приготовления питательных сред состоит из следующих этапов:

1. Варка. Может осуществляться на открытом огне, на водяной бане, с использованием автоклава или варочного котла, которые нагреваются при помощи пара.
2. Установление оптимальной величины pH. Выполняют с применением индикаторных бумажек. Прибор используемый для этой операции – потенциометр или компаратор, которые представляют собой штативы с отсеками для пробирок и набора стандартов pH. При этом в пробирках сравнивают цвета жидкостей с эталонным цветом.
3. Осветление. Эта операция проводится, если в процессе приготовления среда становится мутной или темнеет. Для осветления можно использовать белок куриного яйца, смешанный с двойной порцией воды, который предварительно тщательно перемешивают и кипятят. Иногда для этих целей используют сыворотку крови.
4. Разлив. Осуществляется в специальные пробирки, объемом 3-5 или 10 мл. Это могут быть также флаконы или колбы, специальные бутылки. Если для стерилизации сред используется температура выше 100° С, то их разливают в сухие чистые емкости. Если для стерилизации используется меньшая температура, то разлив осуществляют в стерильные емкости. Для разлива используют воронку, на конце которой есть резиновая трубка с зажимом Мора.Фильтрация. Проводят для жидких и расплавленных желатиновых сред. Для этого используют влажные фильтры на основе бумаги или материи. Агаровые среды труднее фильтровать из-за того, что их застывание происходит достаточно быстро. Вместо этого для агаровых сред чаще всего используют отстаивание, с расплавлением в автоклаве.
5. Стерилизация. Режим стерилизации выбирают с учетом указаний к рецепту и в зависимости от компонентного состава. Примерная схема стерилизации приведена в таблице.
6. Контроль. Стерильность контролируют, используя термостат. Для этого среду ставят в него на двое суток. При отсутствии при осмотре признаков роста среду считают стерильной и отправляют ее на химический контроль. Химический – следующий вид контроля, благодаря которому окончательно устанавливают pH. Его проводят в химической лаборатории. Следующий вид контроля – биологический, с помощью которого определяют питательные свойства среды.

Хранение сред осуществляется при комнатной температуре, в специально предназначенных для этого шкафах. Составы с кровью или витаминами хранят в холодильниках.

Принципы составления простых и сложных питательных сред

Нормальный рост микроорганизмов возможен только в определенной питательной среде, состоящей их конкретного набора компонентов, кроме того эти компоненты должны содержаться в особых пропорциях.

Рецепты простых сред

Изотонический раствор хлорида натрия. Готовится на основе 1 литра дистиллированной воды, смешанной с 9 граммами натрия хлорида. Смесь фильтруют, и устанавливают требуемый pH, после чего при необходимости стерилизуют при температуре 120°С в течение получаса.

Мясопептонный бульон. Мясную воду смешивают с 1% пептона и 0,5% х.ч. натрия хлорида. Далее осуществляют кипячение на медленном огне в течение 10-15 минут до полного растворения ингредиентов. Далее устанавливают требуемый pH, после чего повторно кипятят до момента выпадения осадка. После проведения фильтрации объем дополняют до первоначального и проводят стерилизацию при 120°С в течение 20 минут.

Бульон Хоттинтера. Для приготовления используют перевар Хоттингера, который разводят водой в 5-6 раз с учетом содержания аминного азота. В разведенный перевар добавляют 0,5% натрия хлорида, с последующим кипячении на слабом огне до полного растворения соли. Нужный pH устанавливают в уже остывшей среде, после чего проводят фильтрацию, разлив и стерилизацию в течение 20 минут.

Мясопептонный агар. В готовый бульон (на этапе до или после стерилизации) доливают 2-3% агар-агар с последующим кипячением. Готовят состав на слабом огне с постоянным помешиванием, пока агар полностью не растворится. Для приготовления можно использовать автоклав или аппарат Коха. При необходимости готовую среду можно осветлять, фильтровать или стерилизовать.

В полужидком агаре 0,4-0,5 % агар-агара.

Питательный желатин. Для приготовления используют готовый бульон, в который добавляют 10-15 % желатина. Смесь подогревают, но не кипятят, доводя желатин до полного расплавления, после чего жидкость разливают по стерильным емкостям и проводят стерилизацию с использованием текучего пара.

Рецепты сложных сред

Среды с углеводами. Основной бульон или расплавленный агар дополняют нужным количеством определенного углевода (около 0,1-2%). После того, как он полностью растворился, состав наливают в стерильную посуду и проводят стерилизацию текучим паром. После проведения контроля стерильности среду можно использовать для культивации.

Среды с кровью. Для их приготовления используют простые стерильные среды, в которые в асептических условиях добавлена дефибринированная кровь (до 30%). Среды на основе агара перед добавлением расплавляют и остужают до 45 градусов Цельсия.

Важно! Запрещено растапливать среды с кровью, во избежание изменения свойств состава.

Среды с сывороткой крови. Готовят также, как и предыдущие составы. В основную среду добавляют от 10 до 20% сыворотки без консервантов, которая предварительно инактивирована.

Среды с желчью. В состав простых сред добавляют желчь (10-40% от объема). После устанавливают нужный pH, проводят стерилизацию при температуре 120 градусов по Цельсию в течение 20 минут.

Сухие среды

Выпускают также сухие среды, которые представляют собой порошки в флаконах. На их этикетках указываются правила приготовления составов. Это могут быть как простые, так и специальные среды, а также элективные и дифференциально-диагностические. Удобство сухих составов состоит в том, что они просты в приготовлении и могут использоваться даже в походных условиях. Они могут быть приготовлены из заменителей мяса.

Источник

Методика приготовления питательных сред для выращивания микроорганизмов

Для культивирования микроорганизмов используют различные питательные среды. Это необходимо для дифференциации инфекцион­ных болезней, для приготовления вакцин, антибиотиков и др.

К питательным средам предъявляют следующие требования: должны содержать все необходимые вещества для питания микробов, иметь определенную реакцию среды, быть стерильными и обязательно влажными. Питательные среды подразделяют на Простые и сложные.

К простым средам относятся мясопептонный бульон, мясо­пептонный агар, мясопептонный желатин (МПЖ). Все простые питатель­ные среды готовят на мясной воде. Для ее приготовления мясо отде­ляют от жира и фасций, измельчают, заливают водой в соотношении 1:2 и кипятят в течение 30-60 мин. Затем фильтруют, доливают до перво­начального объема и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.

Приготовление МПБ состоит в следующем. К 1 л мясной воды добавляют 1 % Пептона, 0,5 % Поваренной соли. Устанавливают реак­цию среды (рН 7,2-7,4), кипятят, фильтруют, разливают по колбам и стерилизуют при давлении 0,1 МПа 15-20 мин.

По консистенции питательные среды могут быть Жидкими, полу­жидкими и плотными. Для приготовления полужидких и плотных сред к МПБ добавляют агар (соответственно 0,2-0,3 и 2-3 %). Агар — это вещество, получаемое из морских водорослей. В его состав входят пектиновые вещества. Агар плавится при 90-100 °С и застывает при температуре ниже 45 «С. Как питательное вещество агар микроорга­низмами не используется.

При приготовлении МПА к мясопептонному бульону добавляю 2-3 % Агара, а при приготовлении МПЖ — к мясопептонному бульону добавляют пищевой желатин: 10-12 % — зимой, 18-20 % — летом.

Сложные (специальные) питательные среды готовят для культивирования микробов, которые не растут на обычных, простых средах. Например, яичную среду Петраньяни используют для выращивания туберкулезной палочки. В состав среды входят молоко, картофельная мука, пептон, яичный белок, 2 %-ный водный раствор малахитовой зелени.

К сложным питательным средам относятся дифференциально-диаг­ностические среды (Эндо, Плоскирева и др.), которые служат для отличия одних групп или видов микробов от других. Например, среда Эндо состоит из МПА, лактозы, фуксина основного, обесцвеченного щелочью. На этой среде кишечная палочка растет в виде темно-крас­ных колоний с металлическим блеском, так как сбраживает лактозу с образованием молочной кислоты, которая восстанавливает обесцве­ченный фуксин. Сальмонеллы на среде Эндо растут в виде бесцветных колоний. Они не ферментируют лактозу.

Для выращивания анаэробов готовят среду Китта-Тароцци (МППВ), состоящую из печеночного бульона, кусочков печени на дне пробирки и вазелинового масла, налитого сверху.

Для изучения способности микробов сбраживать сахара в лабора­ториях используют полужидкие углеводные среды, состоящие из пептонной поды, 0,2-0,3 % Агара, моноуглевода и индикатора.

Протеолитнческие свойства микробов (способность расщеплять белки) изучают на желатине, свернутой кровяной сыворотке и молоке.

Среды накопления используют для подавления одних видов микробов и создания благоприятных условий для развития других. Наиболее часто в лабораториях используют накопительные среды (Кауфмана, Мюллера, селенитовую, хлористомагниевую М), которые задерживают рост гнилостных микробов и не препятствуют размноже­нии) сальмонелл.

Для культивирования микробов применяют также синтети­ческие среды, которые включают определенные химические вещества, необходимые для питания микроорганизмов.

Заводы выпускают некоторые питательные среды (МПА, среда Эндо и др.) в высушенном виде, что значительно облегчает метод их приготовления в лабораториях.

Источник

Свойства, приготовление и хранение питательных сред

Свойства и консистенция питательных сред

Питательная среда должна обладать определенным набором свойств:
— содержать достаточное количество питательных веществ, микроэлементов, минеральных солей;
— иметь определенную вязкость;
— иметь определенные влажность и/или кислотность;
— быть изотонической, то есть не нарушать нормальное функционирование клеток, проницаемость клеточных мембран;
— в большинстве случаев, среда должна быть прозрачной.

Питательные среды бывают разной консистенции

К жидким средам относятся растительные экстракты, сыворотка крови, мясной бульон. На основе жидких сред, добавляя определенные количества агар-агара, желатина, силикагеля, получают полужидкие и плотные среды.

Плотные среды применяются для выращивания чистых культур микроорганизмов, для исследования их свойств, для подсчета количества бактерий в исследуемой пробе.

К сыпучим средам относят среды для промышленного производства. Они состоят из измельченного и увлажненного растительного сырья. На их основе изготавливают силосные корма в животноводстве, соевый соус в пищепроме и т. д.

Сухие питательные среды представляют собой гигроскопичный порошок. Это стандартизированные готовые смеси, которые выпускаются промышленным способом и предназначены для приготовления питательных сред в лаборатории. Их преимущества:
— точно известный химический состав;
— долгий срок хранения;
— высокое качество компонентов и высокая степень очистки, которых трудно добиться вне условий специализированной лаборатории;
— удобны при хранении и транспортировке;
— из них просто и быстро можно приготовить питательную микробиологическую среду.

Приготовление питательных сред

Для приготовления питательных сред в лабораториях используют или уже готовые сухие смеси, или проверенные временем рецепты, которые есть в специализированной литературе. Существует более тысячи питательных сред для культивирования различных микроорганизмов. В полужидкие и плотные среды вводят агар-агар или желатин, чтобы добиться нужной консистенции.

После того, как питательная среда изготовлена, ее делают прозрачной, добавляя специальные вещества (например, яичный белок) и отфильтровывая взвешенные частицы. Плотные и полужидкие среды, как правило, фильтруют горячими.

Следующий этап — установить определенный уровень кислотности среды, добавляя раствор кислоты или щелочи. Это очень важно, так как разные микробы и бактерии требуют своего уровня рН. Есть микроорганизмы, которые могут размножаться только в кислой (рН около 9) или только в щелочной (рН=5) среде. Для нейтральной среды уровень кислотности подбирается с точностью до десятых долей, например, рН=7,4. Для контроля кислотности используют цветную индикацию (лакмусовые бумажки, фенолфталеин, метанитрофенол и др.) и фотоколориметры или рН-метры.

Приготовленную питательную среду в конце обязательно стерилизуют, чаще всего методом термообработки, в автоклаве или аппарате Коха. Способ и режим термообработки зависит от вида среды.

Хранение питательных сред

Приготовленные и стерилизованные питательные среды разливают по большим колбам или культуральным бутылям и хранят в темных, холодных помещениях с контролируемой влажностью. Перед применением среды с желирующими компонентами (агаром, желатином) нагревают на водяной бане и разливают через воронку или бюретку по сосудам, в которых будет производиться выращивание культур: по биологическим пробиркам или чашкам Петри. Пробирки устанавливают вертикально или почти горизонтально, чтобы получить среду в виде столбика или скошенную, с увеличенной площадью поверхности.

При работе с аэробными (дышащими кислородом) культурами пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками, которые пропускают воздух, но не посторонние микроорганизмы.

Для выращивания и изучения анаэробных микроорганизмов следует ограничить или исключить доступ кислорода к ним. Для этого культуры выращивают под слоем масла, в глубине плотных сред, в атмосфере из углекислого газа. Иногда в среду добавляют специальные вещества, которые связывают кислород.

Сухие питательные среды хранят в сухом помещении, в хорошо укупоренной посуде.

Источник