Методы изучения микрофлоры почвы

Методы изучения микрофлоры почвы

Важную роль в изучении почвенной микрофлоры играет экологический метод.

При изучении почвенной микрофлоры и вызываемых ею микробиологических процессов, прежде всего, изучаются сообщества микроорганизмов, участвующие в разложении растительных остатков (грибы, маслянокислые и аммонифицирующие бактерии) и минерализации (нитрифицирующие, аэробные целлюлозоразлагающие и др.).

При исследовании микрофлоры почвенных горизонтов необходимо делать разрез почвы.

При взятии проб снимают верхний слой почвы на глубину 0,5 – 1,0 см и очищают наружный слой вертикальной стенки почвенного разреза.

Пробы почвы по слоям и горизонтам необходимо брать чистым и стерильным инструментом.

При изучении микрофлоры почвы проводится количественное определение физиологических групп микроорганизмов.

Санитарными показателями почвы являются: общее микробное число, коли – титр и перфрингенс – титр.

Счет бактерий в грунте проводится двумя методами: методом разливок и прямым методом в той или иной модификации.

При определении содержания бактерий методом разливок необходимо сделать разведение почвенной суспензии, поскольку почва богата бактериями.

Для приготовления разведений необходимо иметь стерильную посуду (колбы, пробирки, пипетки) и стерильную воду или физиологический раствор.

В стерильную колбу, содержащую 100 мл стерильной воды, помещается стерильно отвешенный 1 г почвы и содержимое колбы тщательно взбалтывается.

Из полученной суспензии в пробирках со стерильной водой готовятся разведения почвы 1/100. 1/1000. 1/10 000 г.

Для этого 1 мл основной суспензии стерильно вносится в пробирку с 9 мл стерильной воды, а затем методом переката (из предыдущей пробирки в последующую с 9 мл стерильной воды) готовятся последующие разведения почвы.

После приготовления разведений делаются посевы из основной суспензии и приготовленных разведений в чашки Петри. В чашки Петри к исследуемой суспензии добавляется расплавленный и охлажденный до 42 градусов мясо – пептонный агар (МПА). Содержимое чашек Петри тщательно аккуратно перемешивается (так, чтобы агар не выливался за бортики чашки). Чашки выдерживаются на ровной поверхности до полного остывания агара. Затем все чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат.

Чашки необходимо переворачивать вверх дном для того, чтобы капля образующейся на крышке конденсационной воды не капнула на агар и не обусловила слияние выросших на агаре колоний микроорганизмов.

Слияние колоний не позволит сделать правильно количественный учет особей микробов в исследуемом объеме почвы.

Подсчет выросших колоний производится через 48 часов и через 10 суток. Из всех посевов высчитывают среднее арифметическое число на 1 г влажной и сухой почвы.

Для прямого подсчета бактерий в почве применяют различные способы, в основу которых положен метод прямого счета, разработанный С.Н.Виноградским.

По способу А.С.Разумова 1 г почвы добавляют к 500 мл стерильной водопроводной воды и встряхивают в течение 10 минут.

Полученной суспензии дают отстоятся 2 – 3 секунды и стерильной пипеткой отбирают 4 мл, которые фильтруют через мембранный фильтр.

Фильтр стерильно переносится и наносится на питательную среду в чашке Петри.

После экспозиции в термостате производится подсчет выросших колоний и делается перерасчет на 1 г почвы.

Для выявления микроорганизмов различных физиологических групп и их количественного учета пользуются методом предельных разведений.

С этой целью готовят взвесь почвы в воде (10 г почвы добавляют к 90 мл стерильной воды) и тщательно взбалтывают в течение 5 минут.

Из полученной маточной суспензии готовят разведения и производят посев на соответствующие плотные и жидкие питательные среды.

Для выявления аммонифицирующих бактерий используется пептонная вода.

Признаками развития аммонифицирующих бактерий являются помутнение питательной среды, образование пленки и осадка, положительная реакция на аммиак с реактивом Несслера.

Общее количество маслянокислых бактерий определяют путем посева на картофельную среду. Основным показателем присутствия маслянокислых бактерий является газообразование, пигментация и мацерация картофеля.

Для выявления нитрифицирующих бактерий разведения почвенной суспензии высевают на среду, содержащую аммонийно-магниевую соль фосфорной кислоты. О наличии нитрифицирующих бактерий судят по реакции на азотистую и азотную кислоты и образованию прозрачных зон на поверхности соли.

Для выявления спорообразующих анаэробов, основная почвенная суспензия предварительно прогревается при 80 градусах в течение 20 минут, после чего разведения суспензии высеваются на питательные среды. Посевы выдерживаются в термостате в анаэробных условиях.

При определении перфрингенс – титра разведения почвенной суспензии высеваются в пробирки со средой Вильсон – Блера.

Количество грибов из родов аспергиллюс и пенициллиум определяется путем посева разведений исследуемой почвенной суспензии на сусло – агар.

Источник

Микрофлора почвы

Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроорганизмов, которые принимают участие в процессах формирования и очищения почвы, а также круговорота веществ в природе.

Жизнедеятельность микроорганизмов в почве, их качественный и количественный состав определяется почвенными условиями: наличием питательных веществ, влажностью, аэрацией, реакцией среды, температурой и т.д.

Большое влияние, как на общую численность, так и на соотношение отдельных систематических групп микроорганизмов оказывает тип почвы. Различаясь по физическим и химическим свойствам почва представляет различную среду для жизнедеятельности микроорганизмов. Их больше в увлажненной и обработанной почве (4,2-5,2 млрд/г), меньше в лесной почве, в песках (0,9-1,2 млрд/г). Наиболее обильна микрофлора в верхнем горизонте почвы глубиной 2,5-15 см. В этом слое протекают основные биохимические процессы превращения органических веществ, обусловленные жизнедеятельностью микроорганизмов. На глубине 4-5 м число микроорганизмов значительно снижается, так как уменьшается количество питательных веществ и ухудшаются условия аэрации.

В составе микрофлоры почвы выделяют следующие группы микроорганизмов:

бактерии аммонификаторы, вызывающие гниение трупов животных, остатков растений, разложение мочевины с образованием аммиака и других продуктов: аэробные бактерии – B.subtilis,B.mesentericus,Serratiamarcescens; бактерии родаProteus; грибы родаAspergillus,Mucor,Penicillium; анаэробы –C.sporogenes,C.putrificum; уробактерии –Urobacilluspasteuri,Sarcinaurea, расщепляющие мочевину;

нитрифицирующие бактерии: NitrobacterиNitrosomonas(Nitrosomonasокисляют аммиак до азотистой кислоты, образуя нитриты,Nitrobacterпревращают азотистую кислоту в азотную и нитраты);

азотфиксирующие бактерии: усваивают из воздуха свободный кислород и в процессе своей жизнедеятельности из молекулярного азота синтезируют белки и другие органические соединения азота, используемые растениями;

бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов – серобактерии, железобактерии и т.д. (серобактерии окисляют сероводород до серной кислоты, железобактерии окисляют соединения железа до гидрата окиси железа, фосфорные бактерии способствуют образованию легко растворимых соединений фосфора);

бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие брожение (молочнокислые, спиртовые, маслянокислые, уксусные, протионовые и др.).

С выделениями человека и животных, с фекально-бытовыми сточными водами в почву могут попадать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы (возбудители грибковых заболеваний, ботулизма, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы, бруцеллеза, лептоспироза, кишечных инфекций и др.).

Санитарно-бактериологическое исследование почвы

При исследовании почвы может проводиться полный или краткий анализ.

Полный санитарно-бактериологический анализ почвы проводится:

а) для подробной и глубокой характеристики санитарного состояния почвы;

б) для определения пригодности почвы при размещении жилья, мест отдыха, детских учреждений и водопроводных сооружений;

в) для эпидемиологических исследований.

Краткий анализ рекомендуется при осуществлении текущего санитарного надзора и включает определение общего количества сапрофитных бактерий, БГКП (коли-титр и коли-индекс), клостридий (перфрингенс-титр), термофильных бактерий, нитрифицирующих.

В полный санитарно-бактериологический анализ входят дополнительно: определение актиномицетов, грибов, сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, бруцеллеза, сибирской язвы.

Почву освобождают от включений – камней, осколков стекла и др. Крупные агрегаты почвы дробят. Навеску почвы в количестве 30 г заливают стерильной водопроводной водой в соотношении 1:10. Полученную суспензию встряхивают 10 мин и отстаивают 2-5 мин. Из первого разведения 1:10 готовят ряд последующих 10-ти кратных разведений от 1:10 до 1:1000 при исследовании чистых почв и до 1:10 000 при исследовании сильно загрязненных почв.

Определение общего количества сапрофитных бактерий

(микробное число почвы)

Микробное число почвы – общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы.

Посев почвенной суспензии производят на МПА в чашки Петри по 1 мл из каждого разведения. Затем в чашки выливают по 7-10 мл расплавленного и остуженного до 45 0 С агара. Посевы инкубируют при 28-30 0 С в течение 72 ч и подсчитывают количество выросших колоний. Если на чашке Петри вырастает более 150 колоний, то подсчет ведется на ¼ площади с последующим перерасчетом на всю площадь. Из суммы колоний, подсчитанных на всех чашках Петри, выводится среднее арифметическое и затем определяют количество микроорганизмов в 1 г почвы с учетом разведений.

Определение бактерий группы кишечной палочки

Коли-индекс – количество жизнеспособных E.coliв 1 г почвы.

При анализе малозагрязненных почв используют метод мембранных фильтров. При предполагаемой невысокой степени фекального загрязнения рекомендуется применение титрационного метода. При высокой степени фекального загрязнения рекомендуется метод прямого посева почвенной суспензии (1:10) на среду Эндо.

Метод мембранных фильтров. Почвенную суспензию 1:10 центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, затем 5-10 мл суспензии фильтруют через мембранные фильтры №3 в аппарате Зейтца. После фильтрования верхнюю часть прибора снимают и фильтр осторожно стерильным пинцетом переносят на среду Эндо в чашку Петри. Фильтр накладывают вверх поверхностью, на которой осели бактерии. Чашки Петри инкубируют при 37 0 С 24 ч. При наличии в почве БГКП на фильтрах появляются колонии типичные для кишечных палочек – темно-красные с металлическим блеском или розовые с красным центром. Из таких колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Для отличия бактерий семействаEnterobacteriaceaeотPseudomonadaceaeставят оксидазный тест. Для этого на культуру микроорганизмов в чашке Петри наносят индикатор – 1% раствор диметилпарафенилендинитролазы. В положительном случае через 15-20 мин появляется темно-синее окрашивание. Колонии учитывают как БГКП, если они образованы грамотрицательными палочками, ферментирующими глюкозу до кислоты и газа и не обладающие протеолитической активностью.

Колонии подсчитывают на тех фильтрах, на которых из соответствующего разведения почвенной суспензии выросло не более 30-50 колоний.

Пересчитывают количество выросших колоний на фильтрах на 1 г почвы и определяют коли-индекс.

Коли-титр почвы – наименьшее количество почвы, в котором обнаруживается жизнеспособная E.coli.

Титрационный метод. Из приготовленных разведений почвенной суспензии делают посевы в питательную среду Кесслера (1% пептона, 5% желчи, 0,25% лактозы, генциановый фиолетовый). Из разведений 1:10 10 мл засевают во флакон с 50 мл среды, что соответствует 1 г почвы. Посев меньших количеств (0,1 и 0,01) делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9 мл среды. Отсутствие во всех пробирках роста и газообразования указывает на отсутствие БГКП. Если в посевах обнаруживается рост или рост и газообразование, делают высев в чашки Петри со средой Эндо или в пробирки с розоловым агаром, инкубируют 24 ч при 37 0 С и проводят дальнейшую идентификацию выделенных бактерий. Результат выражают в коли-титре.

Перфрингенс-титр почвы – наименьшее весовое количество почвы, выраженное в граммах, в котором обнаруживается жизнеспособная клетка C.perfringens.

Определение перфрингенс-титра является важным критерием для санитарной оценки почвы и ее самоочищения, так как в почве, загрязненной фекалиями, уже через 4-5 мес эшерихии исчезают, а C.perfringensобнаруживаются в титре 0,01. Перфрингенс-титр дает возможность судить о давности фекального загрязнения.

Из приготовленных разведений почвенной суспензии по 1 мл переносят в два параллельных ряда пробирок. Один ряд прогревают при 80 0 С 15 мин. Затем во все пробирки наливают по 9-10 мл расплавленной и охлажденной до 45 0 среды Вильсона-Блер. Инкубацию посевов проводят при 43 0 24 ч, но уже через 2-3 ч при положительном результате можно наблюдать в толще агара образование круглых колоний черного цвета. В мазках приготовленных из колоний видны характерные грамположительные палочки.

Определение термофильных бактерий

Учет термофильных бактерий производят на МПА, разлитом в чашки Петри более толстым слоем, чем обычно. Посев делают из разведений 1:10, 1:100, 1:1000, причем из каждого разведения рекомендуется засевать по 2-3 параллельные чашки. Термофильные бактерии выращивают при температуре около 60 0 . Результат учитывают через 24 ч после посева. Подсчет количества бактерий проводят на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическая оценка почвы

Ее производят по комплексу показателей. Для санитарной оценки почвы необходимо пользоваться показателями таблицы 2.

Схема санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям

Источник

Микрофлора почвы – научно практические аспекты изучения населяющих микроорганизмов

Вызовы и задачи, стоящие перед учеными, все больше уходят от чисто теоретических вопросов в плоскость практического применения методик управления биологическими ресурсами планеты. Одним из таких практических направлений, способных дать быстрый и эффективный результат в решении вопроса обеспечения продовольствием человечества выступает микробиология почв. Изучение форм и видов живых организмов грунта, способность их обеспечить положительную динамику сельхозпроизводства, обеспечение процесса очистки и восстановления плодородия все эти вопросы становятся сегодня особенно важными и актуальными.

Количественный и видовой состав микроорганизмов почвы

Тесная связь между всеми формами жизни на земле делает человечество зависимым даже от таких форм жизни как микроорганизмы. Примером такой зависимости может быть факт, что 80% кислорода на планете производится при непосредственном участии зеленых водорослей в мировом океане. Известные формы жизни на планете играют одну из ведущих ролей в процессе образования повышения плодородия и других почвообразовательных процессах. Микрофлора почвы поражает своим многообразием. Многие виды живых организмов имеют уникальную структуру и такие же уникальные свойства.

По мнению академика В.Л. Омелянского микроорганизмы окружающие нас «сопровождают человека, вторгаясь в его жизнь, то, как друзья, то как враги». Микрофлора почвы, населенная многочисленными видами микробов, грибов, одноклеточных растений характеризуется способностью потреблять в пищу разнообразные формы продуктов, отличной приспособляемостью к внешним условиям – влажности, перепадам температуры и высокой способностью производить потомство.

Большинство видов микроорганизмов представляют собой одноклеточные организмы, но довольно часто встречаются и многоклеточные и даже такие, которые можно отнести к доклеточным формам жизни. Многие виды можно отнести к растительности, а многие к животному миру. Распространение микрофлоры в почвенном покрове неоднородно, это и является одним из важнейших свойств почвы – и полезные и имеющие патогенный характер микроорганизмы присутствуют в отдельных местах земного покрова, образуя колонии. Так или иначе все виды грибов, бактерий и вирусов взаимодействуют с растениями, животными и человеком внося свои коррективы в ход жизни.

Почва, как и вода и воздух, является естественной средой обитания не только животных и растений, но и микроорганизмов. Как и другие обитатели этой планеты, мир микрофлора распределяется в почве неоднородно. Здесь большую роль играют:

• Физико-химические качества покрова;
• Наличие питательных веществ для существования;
• Наличие необходимой для жизни влаги;
• Защита от прямых солнечных лучей;
• Степень аэрации почвенного покрова.

Микрофлора почвы содержит бактерии, грибы, водоросли.

Обилие видов и форм живых организмов существенно зависит и от климатических особенностей региона. Чем тяжелей и жестче климат, тем меньше видов микроорганизмов населяющих почву.

Неоднородно и расположение зон обитания видов микрофлоры. Менее всего насыщена верхняя часть грунта, здесь на глубине 5-7 мм от поверхности располагаются только самые выносливые виды, которым критически необходимым условием существования выступает наличие солнечного света.

Слой почвы, находящийся ниже, наоборот, населен максимально – здесь наблюдается наивысшая концентрация жизни – всего 5-10 см от поверхности включает в себя около 80% живых организмов. Далее, по мере углубления в слой почвы количество живых организмов сокращается, уже на глубине около 30 см общее количество микроорганизмов в 25-30 раз меньше чем на поверхности.

Основными видами обитателей почвенного покрова выступают:

• Бактерии;
• Актиномицеты;
• Грибы;
• Водоросли;
• Простейшие животные.

Среди постоянно обитающих в почве микроорганизмов также нужно отнести:

• Гнилостные бактерии;
• Спороносные виды;
• Аэробные бактерии;
• Анаэробные бактерии;
• Бактерии, разлагающие клетчатку;
• Нитрифицирующие и денитрифицирующие виды бактерий;
• Азотофиксирующие микроорганизмы;
• Бактерии поглощающие серу и железо.

Вместе с этими видами живых организмов в почве встречаются и живые организмы являющиеся возбудителями опасных болезней. Для этих представителей патогенных бактерий относятся:

• Возбудитель дизентерии;
• Бактерии столбняка;
• Возбудители сибирской язвы;
• Возбудители различных форм чумы.
• Кишечной палочки.

Каждый и видов бактерий выполняет важную, строго определенную природой роль. Образуемые различными видами бактерий и микробов сообщества и ассоциации взаимодействуют между собой в рамках выполнения своих биологических функций. Сформированные, таким образом связи и взаимоотношения обеспечивают биологическое равновесие между различными формами жизни на планете.

Принципы исследования почвенной микрофлоры

К методам исследования почвенной микрофлоры относятся методы количественного и качественного изучения состава экосистемы. Среди принципов исследований,одинаковыми для обоих методов выступают:

• Научность исследования;
• Достоверность полученных данных;
• Использование при исследовании стандартизованных методов исследования;
• Объективность проведения эксперимента.

Для методов количественного и качественного анализа допускается проведение полного или краткого анализа почвы. Полный, качественный анализ почвы проводится в нескольких случаях:

• При определении полной характеристики санитарного состояния почвы;
• Для определения безопасного, пригодного состояния участка для строительства жилья, возведения промышленных и гражданских объектов;
• При проведении эпидемиологических исследований.

Среди методов исследования почвы, в котором исследуются количественные показатели микрофлоры почвы одним из самых распространенных выступает метод прямого микроскопирования. Суть метода заключается в прямом исследовании общего числа микроорганизмов в 1 грамме грунта.

При исследовании используются обычные микроскопы. Из заготовленного образца исследования готовится раствор суспензии на предметном стекле. При проведении изучения с помощью обычного оптического микроскопа в поле зрения исследователя могут быть выявлены:

• Палочковидные бактерии;
• Кокки различных видов;
• Мицелий грибов разных форм;
• Актиномицеты;
• Другие формы микроорганизмов определяемые при помощи микроскопа.

При исследовании почвы могут быть выявлены палочковидные бактерии

В процессе исследования определяется количественный состав микрофлоры.

Другим методом проведения качественного анализа выступает использование капиллярной камеры, в которой происходит подсчет микрофлоры. Проведя подсчет бактерий в капилляре, без труда можно определить приблизительное количество микроорганизмов в 1 грамме почвы.

Применение более современных электронных микроскопов дает возможность определить большее количество форм живых организмов, которые при наблюдении из обычного микроскопа невидимы. Данный метод хорош еще и тем, что для исследователя есть возможность оставить провести наблюдение не только в формате реального времени, а и продолжить его при помощи компьютерных методик исследования.

Применение количественных методов дает возможность определить общее количество микроорганизмов в определенном объеме. При проведении комплексного исследования этого результата недостаточно. Куда более важно определить динамику роста колоний, их функции и возможности, взаимодействие с другими видами микроорганизмов.

В ходе таких исследований, когда основным предметом выступают качественные показатели проводятся опыты в ходе которых образцы бактерий переносятся на специальные питательные среды, чтобы определить их качественные показатели. Косвенно этот метод позволяет определить и порядок взаимодействия разных групп в экосистеме.

Другим направлением исследования качественного состояния микрофлоры выступает возможность определить массу микроорганизмов в почве и спрогнозировать возможности этих колоний для получения урожая.

Качественный анализ почв позволяет определить и отдельные группы микроорганизмов, наличие которых существенно влияет на эпидемиологический характер участка. Это исследование проводится методом титра. В ходе опыта делается избирательное помещение образцов в разные питательные среды. После этого проводится наблюдение за образцами, и выделяются искомые представители микрофлоры интересные для исследования. Этот метод чаще всего применяется для определения экологической безопасности участка.

Нюансы управления микробиотическими процессами в почве

Современные технологии управления биологическими ресурсами предусматривают несколько возможностей проведения мероприятий по повышению качества грунтов. Кроме традиционных методов повышения плодородия в виде внесения удобрений в почву наука предлагает другие методы интенсификации сельхозпроизводства.

Так, на сегодняшний день получила распространения технология управления микробиотическими процессами. В практическом плане сегодня эта технология реализуется в двух основных направлениях:

• Применение биологических средств для работ по рекультивации земель, восстановлению их пригодности для сельхозработ.
• Применение биопрепаратов для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и защите их от вредителей и болезней.

Применение биопрепаратов для повышения урожайности почвы

Обе технологии основываются на использовании искусственно выращенной полезной микрофлоры для внесения в грунт. Первым этапом применения этой технологии выступает проведение комплексной оценки состояния почвенного покрова. В процессе исследования определяется наличие микроорганизмов в грунте, их жизнеспособность и возможность привлечения для решения поставленных задач. Отдельным пунктом этого исследования стоит вопрос выявления опасных для человека микроорганизмов.

Вторым этапом является процесс поиска наиболее эффективного типа микроорганизмов, способных в конкретных условиях решить поставленную задачу. Чаще всего исследование проводится по двум направлениям – поиск основного вида бактерий или других организмов и выявление конкурирующих групп, способных вступить в борьбу за жизненное пространство. Параллельно, исследуются положительные и отрицательные факторы местного физико-химического фона почвы, которые могут существенно повлиять на результат работ.

Во время практической фазы сначала проводится культивация в условиях инкубаторов необходимого количества биологического продукта для внесения в почву или обработку растений. Чаще всего биологически активные препараты применяются в виде водной дисперсии при поливе или мероприятиях по защите растений от вредителей.

В практическом плане показать эффективность технологии применения микробиологических препаратов можно на примере переработки отходов выращивания птицы и свиней. Крупные производители курятины и свинины постоянно сталкиваются с проблемой утилизации отходов. Специфика состоит в том, что даже на небольшой ферме спустя некоторое время некуда девать скопившийся навоз. А учитывая, что куриный помет обладает повышенной токсичностью, то эта проблема становится еще более острой. Единственно правильным выходом здесь выступает применение биопрепаратов, способных быстро провести переработку отходов и одновременно вернуть плодородие занимаемым землям. Биопрепараты обеспечивают быстрое разложение навоза и превращение его в компост. Более современные средства дают возможность использовать навоз в качестве основы для приготовления биогаза.

Внесенные же в грунт бактерии обеспечивают рекультивацию почвы и возвращение ей плодородных качеств в течение 2-4 лет.

Источник