Методы санитарно микробиологического исследования почвы

Глава 19 САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЫ

Почва является важнейшей средой обитания микроорганиз­мов, вместе с растениями и животными они составляют слож­ные и многообразные биоценозы, состав которых и функцио­нальная активность зависят в основном от типа и структуры почвы, состава минеральных и органических веществ, клима­тических условий и сезонности, физико-химического состоя­ния, интенсивности инсоляции. Существенное влияние на микробиоценоз почвы оказывает антропотехногенное воздей­ствие: вспашка, мелиорация, внесение удобрений и ядохими­катов, свалки бытовых и промышленных отходов. Почва как фактор окружающей среды может служить источником вторич­ного загрязнения подземных и поверхностных вод, атмосфер­ного воздуха и сельскохозяйственной продукции. Состав мик­рофлоры меняется в зависимости от глубины почвы. В по­верхностном слое почвы (0–10 см), как правило, количество микроорганизмов незначительно; это связано с губительным действием прямого солнечного света и низкой влажности поч­вы. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается на глубине 10–30 см. На глубине 1 м выявляются еди­ничные клетки бактерий. Наиболее богата микроорганизмами культурная возделываемая почва (до 5 млрд клеток в 1 г поч­вы), наименее – почва, бедная влагой и органическими веще­ствами (200 млн клеток в 1 г).

Оценить микробный пейзаж почвы и степень ее опасности для здоровья населения, активность протекающих процессов самоочищения можно при ведении мониторинга за балансом постоянных обитателей и состоянием микроорганизмов, попа­дающих в почву с выделениями человека и животных, для которых почва служит местом кратковременного (кишечная палочка – до 8 мес, брюшнотифозные палочки – от несколь­ких дней до 3 мес, шигеллы – от 14 до 100 дней) или длитель­ного пребывания (спорообразующие бактерии – сибиреязвен­ная палочка, возбудитель столбняка и газовой гангрены – го­дами и десятилетиями).

Необходимо отметить, что с увеличением химической на­грузки на почву нарушается баланс микроорганизмов, увели­чивается количество положительных находок патогенных бак­терий и геогельминтов, которые являются более устойчивыми, чем представители почвенных бактерий, в связи с чем возрас­тает эпидемическая опасность почвы для человека и животных.

Санитарно-гигиенический надзор за состоянием почвы предусматривает определение и прогноз степени их опасности для здоровья людей в населенных пунктах, а также разработку мероприятий по их рекультивации, профилактике инфекцион­ной и неинфекционной заболеваемости, схем районной пла­нировки и охраны водосборных территорий. Результаты над­зора учитывают при решении очередности оздоровительных мероприятий в рамках комплексных природоохранных про­грамм, оценке эффективности реабилитационных и санитарно-экологических мероприятий и текущего санитарного кон­троля за объектами, прямо или косвенно воздействующими на окружающую среду населенного пункта.

Группа почвенных микроорганизмов (спорообразующие бак­терии, актиномицеты, грибы, нитрифицирующие бактерии и др.) принимает участие в круговороте азота, серы и фосфора, а также в процессах самоочищения почвы.

Оценка санитарного состояния почвы проводится по ре­зультатам анализов почв на объектах повышенного риска (дет­ские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т.п.) и в санитарно-защитных зонах по следующим индикаторным показателям:

– косвенным показателям, характеризующим интенсивность биологической нагрузки на почву. Это санитарно-показа-тельные микроорганизмы бактерий группы кишечной па­лочки (БГКП) – общие колиформные бактерии (ОКБ) и фекальные энтерококки (индекс энтерококков). В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика и как следствие высоки индексы санитарно-показательных микроорганизмов, что наряду с санитарно-химическими показателями (динамика аммиака и нитратов, санитарное число) свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфициро­вания. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое со­держание вегетативных форм С.perfringens. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели;

– прямым санитарно-бактериологическим показателям эпиде­мической опасности почвы – обнаружением возбудителей кишечных инфекций (возбудители кишечных инфекций, патогенные энтеробактерии, энтеровирусы).

Оценка эпидемической опасности почв населенных пунктов (табл. 19.1). При отсутствии возможности прямого определения в почвах энтеробактерии и энтеровирусов оценка безопасности может быть проведена ориентировочно по индикаторным мик­роорганизмам.

Почву оценивают как чистую без ограничений по санитар­но-бактериологическим показателям при отсутствии патоген­ных бактерий и индексе санитарно-показательных микроорга­низмов до 10 клеток на 1 г почвы. При загрязнении почвы сальмонеллами индекс санитарно-показательных организмов БГКП и эктерококков достигает 10 клеток на 1 г почвы и более. Концентрация колифага в почве на уровне 10 БОЕ/г и более также свидетельствует о загрязнении почвы.

Показатели биологической активности почвы. Исследования биологической активности почвы проводятся при необходи­мости углубленной оценки ее санитарного состояния и спо­собности к самоочищению.

Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), численность основных групп почвенных микроорга­низмов (почвенных сапрофитных бактерий, актиномицетов, почвенных микромицетов), показатели интенсивности транс­формации соединений углерода и азота в почве («дыхание» почвы, санитарное число, динамика азота аммиака и нитратов в почве, азотфиксация, аммонификация, нитрификация и де-нитрификация), динамика кислотности и окислительно-вос­становительного потенциала в почве, активность ферментатив­ных систем и другие показатели.

Перечень показателей определяется целью исследования. На первом этапе исследований целесообразно использование наиболее простых и быстро определяемых информативных ин­тегральных показателей: «дыхание» почвы, общая микробная численность, окислительно-восстановительный потенциал и кислотность почв, динамика азота аммиака и нитратов. Даль­нейшее углубленное исследование проводится в соответствии с полученными результатами и общими задачами исследова­ния.

Так, почву можно считать «незагрязненной» по показателям биологической активности при изменении микробиологичес­ких показателей не более 50 % и биохимических – не более 25% по сравнению с такими же показателями для контроль­ных, принятых в качестве чистых, незагрязненных почв.

Отбор проб для бактериологического анализа проводится не реже 1 раза в год в местах возможного нахождения людей, животных, в местах загрязнения органическими отходами. При изучении динамики самоочищения почвы отбор проб осущест­вляют в течение первого месяца еженедельно, а затем ежеме­сячно в течение вегетационного периода до завершения актив­ной фазы самоочищения.

При выборе объектов в первую очередь обследуют почвы территорий повышенного риска воздействия на здоровье насе­ления (детские дошкольные, школьные и лечебные учрежде­ния, селитебные территории, зоны санитарной охраны водо­емов, питьевого водоснабжения, земли, занятые под сельхоз­культуры, рекреационные зоны и т.д.). На данных объектах отбор проб проводится 2 раза в год, размер пробной площад­ки – не более 5×5 м. На территории детских учреждений и игровых площадок пробы отбирают отдельно из песочниц и с общей территории с глубины 0–10 см.

Из каждой песочницы или с игровой территории отбирает­ся одна объединенная проба, составленная из 5 точечных проб. Допускается отбор изо всех песочниц или со всех игро­вых территорий каждой возрастной группы одной объединен­ной пробы, составленной из 8–10 точечных проб загрязнения почв.

Санитарно-бактериологический контроль почв населенных пунктов проводится с учетом функциональных зон города. Места отбора проб предварительно отмечаются на картосхеме, отражающей структуру городского ландшафта. Пробная пло­щадка (часть исследуемой территории, характеризующаяся сход­ными условиями, рельефом, однородностью структуры почвы и растительного покрова, характером хозяйственного исполь­зования) должна располагаться на типичном для изучаемой территории месте. При неоднородности рельефа площадки вы­бирают по элементам рельефа. На территорию, подлежащую контролю, составляют описание с указанием адреса, точки отбора, общего рельефа микрорайона, расположения мест от­бора и источников загрязнения, растительного покрова, характера землепользования, уровня грунтовых вод, типа почвы и других данных, необходимых для правильной оцен­ки и трактовки ре­зультатов анализов об­разцов.

При контроле за за­грязнением почв про­мышленными источ­никами площадки для отбора проб распола­гают на площади трех­кратной величины санитарно-защитной зо­ны вдоль векторов розы ветров на расстоянии 100, 200, 300, 500, 1000, 2000, 5000 м и более от источника загрязнения (ГОСТ 17.4.4.02-84).

При изучении загрязнения почв в районе транспортных магистралей пробные площадки закладывают на придорожных полосах с учетом рельефа местности, растительного покрова, метео- и гидрологических условий. Пробы почвы отбирают с узких полос длиной 200–500 м на расстоянии 0–10, 10–50, 50–100 м от полотна дороги. Одна смешанная проба состав­ляется из 20–25 точечных, отобранных с глубины 0–10 см.

При оценке сельскохозяйственных территорий пробы почвы отбирают 2 раза в год (весна, осень) с глубины 0–25 см. На каждые 0–15 га закладывается не менее одной площадки раз­мером 100–200 м2 в зависимости от рельефа местности и условий землепользования. Для взятия проб применяют бур Некрасова (рис. 19.1).

На территории крупных городов с многочисленными источ­никами загрязнения проводят геохимическое картирование по сети апробирования. Для выявления очагов загрязнения ре­комендуемая плотность отбора 1–5 проб на 1 км 2 с расстоя­нием между точками отбора 400–1000 м. Для дальнейшего выделения территории с максимальной степенью загрязнения сеть апробирования сгущается до 25–30 проб на 1 км 2 с рас­стоянием между точками отбора около 200 м. Пробы отбирают с глубины 0–5 см.

Точечные пробы отбирают в соответствии с ГОСТом 17.4.4.02-84, с соблюдением стерильности для санитарно-микробиологических исследований методом конвертов. Объединенную пробу составляют из равных по объему точечных проб (не менее 5), отобранных на одной площадке. Объединенные про­бы упаковывают в чистые полиэтиленовые пакеты, закрывают, маркируют, регистрируют в журнале отбора проб и пронуме­ровывают. На каждую пробу составляют сопроводительный талон, вместе с которым пробу вкладывают во второй внешний пакет, что обеспечивает целостность и безопасность их транс­портирования. Время от отбора проб до начала их исследова­ний не должно превышать 1 сут. В лаборатории пробу осво­бождают от посторонних примесей, доводят до воздушно-су­хого состояния, тщательно перемешивают и делят на части для проведения анализа. Отдельно оставляют контрольную часть от каждой анализируемой пробы (около 200 г) и хранят в холодильнике 2 нед на случай арбитража.

Подготовка и обработка почвы для анализа. Для приготов­ления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, перемешивают и распределяют в форме квадрата, диагоналя­ми почву делят на 4 треугольника, почву из двух противопо­ложных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь пере­мешивают и далее повторяется приведенная выше процедура до тех пор, пока не останется 0,5 кг почвы. Перед посевом почву просеивают через сито диаметром 3 мм.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбира­ют навески, величины которых выбирают исходя из предпола­гаемой степени загрязнения почвы и планируемых определе­ний. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навес­ки от 1 до 10 г. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде (например, 1 г почвенной суспензии раз­водят в 10 мл стерильной водопроводной воды, 10 г почвы – в 100 мл воды и т.д.). После приготовления разведений при­меняют соответствующую предварительную обработку почвы с целью извлечения клеток микроорганизмов из почвенных агре­гатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц при помощи:

• 10-минутного вертикального встряхивания почвенной сус­пензии первого разведения в пробирках с резиновыми проб­ками;
• 3-минутной обработки почвенной суспензии первого разве­дения на мешалке механического диспергатора (размельчитель тканей марки РТ-2) – при навеске почвы более 1 г.

Почву разводят до 0,0001–0,00001 г/мл (10 -4 –10 -5 ). При­готовленные разведения используются для посева на различ­ные питательные среды, а также для учета численности мик­роорганизмов методом прямой микроскопии.

Источник

17.2. Санитарно-микробиологическое исследование почвы

Почва является естественной средой обитания микроорганизмов. В ней имеются все условия для благоприятного их развития (достаточное количество влаги, органических и минеральных веществ). Из природных субстратов почва обильно заселена микроорганизмами, которые составляют ее постоянную микрофлору. Санитарно-гигиеническая роль этой микрофлоры огромна. Почвенные микроорганизмы участвуют в минерализации органических отбросов, самоочищении почвы, в круговороте веществ в природе.

В почву могут попадать патогенные микроорганизмы со сточными водами, с трупами людей и животных. В связи с этим почва может служить источником распространения возбудителей инфекционных болезней, через почву загрязняются объекты окружающей среды, может происходить обсеменение сапрофитными и болезнетворными микроорганизмами сырья, пищевых продуктов, кормов.

Количественный и видовой состав микроорганизмов в почве обусловлен содержанием в ней органических веществ, влаги, рН, температурой, климатическими условиями и т.д.

В составе микрофлоры почвы принято выделять так называемые физиологические группы микроорганизмов, которые участвуют в различных процессах и на разных этапах постепенного разложения органических веществ, к которым относятся:

1. Аммонофикаторы (гнилостные).

2. Нитрифицирующие бактерии.

4. Бактерии, расщепляющие клетчатку, а также вызывающие различные брожения (молочнокислое, спиртовое, маслянокислое и др.)

5. Бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора других элементов.

В почве могут быть и патогенные бактерии, продолжительность их выживаемости зависит от вида и условий внешней среды.

Неспорообразующие патогенные бактерии и вирусы погибают в ней в течение нескольких суток или месяцев, в частности, возбудитель туберкулеза в почве сохраняется до 1 года.

Особое место занимают возбудители почвенных инфекций (сибирской язвы, эмфизематозного карбункула, столбняка, ботулизма), которые образуют споры и сохраняются в почве годами, а возбудитель сибирской язвы – десятки лет.

Краткий санитарно-бактериологический анализ почвы включает определение двух показателей: общего количества микробов (в 1 г почвы) и коли-титра.

В отдельных случаях в почве определяют возбудителей сибирской язвы, столбняка, ботулизма.

Отбор проб почвы. На обследуемой территории до 1000 м выделяют два участка по 25 м 2 каждый: один участок выбирают вблизи, другой – вдали от источника загрязнения. С каждого участка отбирают среднюю пробу, составленную из 5 образцов, взятых по диагонали или в четырех точках по краям и в одной в центре. Образцы берут на глубине до 20 см, при исследовании почвы скотомогильников – ниже глубины захоронения не менее чем на 25 см, Пробы отбирают стерильной железной лопаткой, совком или специальным буром в стерильные широкогорлые банки, которые закрывают ватными пробками. К банке приклеивают этикетку с датой и номером отобранной почвы.

Масса каждого образца должна быть 200-300 г, а смешанного – не менее 1 кг. Отобранные пробы почвы направляют в лабораторию и исследуют сразу же или не позднее чем через 12-18 ч при хранении при 1-5 °С.

В колбу на 500 мл, наливают 270 мл стерильной водопроводной воды и вносят 30 г исследуемой почвы. Колбу с содержимым встряхивают в течение 10 мин. Из полученного разведения почвы 1:10 -1 готовят десятикратные разведения: для чистых почв 1:10 -2 до 1:10 -4 , для загрязненных – до 1:10 -6 и больше.

Определение общего микробного числа (ОМЧ)

Из последних 3-4 пробирок приготовленных разведений берут 1 мл и переносят в стерильные чашки Петри (не менее двух чашек на каждое разведение). В эти чашки заливают по 10 мл расплавленного и охлажденного до 45°С МПА и тщательно перемешивают. Посевы культивируют в термостате при 37°С 24-48 ч.

Учет результатов проводят путем подсчета выросших колоний и определения среднеарифметического числа. Полученное число колоний умножают на степень разведения исследуемой почвы, получая число бактерий в 1 г почвы.

Определение коли-титра почвы методом бродильных проб с использованием среды Кесслера. Исследования проводят в три этапа. На первом этапе готовят разведения: для чистых почв от 1:10 -1 до 1:10 -3 : для загрязненных – от 1:10 -3 до 1:10 -6 . После тщательного перемешивания 1 мл полученной суспензии из различных разведений переносят в пробирку с 9 мл среды Кесслера (на 1 л дистиллированной воды 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи, 2,5 г лактозы, 4 мл 1%-ного водного раствора генцианвиолета). Посевы культивируют при 43°С в течение 48 часов.

На втором этапе исследования просматривают посевы на среде Кесслера. Из пробирок с наличием газа продолжают высев на среду Эндо. Посевы культивируют при 37°С в течение 24 ч.

На третьем этапе исследуют колонии, выросшие на среде Эндо. Отбирают колонии, типичные для бактерий группы кишечных палочек, готовят из них мазки, красят по Граму, микроскопируют. При обнаружении в мазках коротких полиморфных грамотрицательных палочек производят высев из этих колоний на среду Кесслера для подтверждения газообразования в чистой культуре.

Источник