Микробное число почвы определение

ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I — Л. В. Красникова — 2016

13. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЧВЫ

Цель работы: провести микробиологическое исследование почвы как источника контаминации пищевых продуктов посторонними микроорганизмами.

Почва обильно заселена микроорганизмами. В ней встречаются все формы микроорганизмов, которые существуют на Земле: бактерии, вирусы, актиномицеты, дрожжи, грибы, простейшие. Общее микробное число (ОМЧ) в 1 г почвы может достигать от 1,0 до 10 млрд. В разных слоях почвы количество микроорганизмов неодинаково. В самом верхнем слое (0,5 см) микроорганизмов очень мало. На глубине от 1-5 см до 30-40 см число микроорганизмов максимально — в среднем от 10 до 50 млн в 1 г. После 30-40 см глубины ОМЧ постепенно снижается и в более глубоких слоях оно минимально.

Микрофлору почвы делят на 2 группы:

1) аутотрофная — питается минеральными веществами;

2) гетеротрофная — питается органическими веществами.

Обе группы участвуют в процессах самоочищения почв, их минерализации. Однако в группе гетеротрофных микроорганизмов может присутствовать патогенная микрофлора. При загрязнении почвы фекалиями людей, больных кишечными инфекциями, продукты растительного происхождения могут быть контаминированы возбудителями дизентерии, холеры, брюшного тифа, сальмонеллеза, энтеровирусами. Установлена прямая зависимость между уровнем заболеваемости человека и животных кишечными инфекциями и неудовлетворительным санитарным состоянием почвы. Через почву передаются возбудители таких инфекционных заболеваний, как сибирская язва, газовая гангрена, столбняк и др.

При санитарно-микробиологическом анализе почвы определяют общее микробное число, колититр, перфрингенс-титр, титр нитрифицирующих бактерий и количество протеев и термофильных бактерий. Микробное число характеризует загрязненность почвы органическими веществами. Присутствие в почве бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о ее фекальном загрязнении. Обнаружение в почве палочки Clostridium perfringens также указывает на ее фекальное загрязнение. Наличие в почве бактерий рода Proteus дает основание считать возможным загрязнение почвы органическими веществами животного происхождения или фекалиями человека. Присутствие термофильных микроорганизмов указывает на загрязнение почвы навозом или компостами. В чистых почвах термофильные микроорганизмы, как правило, не обнаруживаются.

Взятие проб почвы. При проведении микробиологических исследований поверхностных слоев почвы образцы берут на глубине 15-20 см, снимая верхний слой толщиной 2 см (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб). Отбирают пробы маленькой железной лопаткой или совком в стерильные широкогорлые банки, завернутые в бумагу и снабженные этикеткой. Каждый взятый образец должен весить 200-300 г, а смешанный образец (средняя проба) — не менее 1 кг.

Подготовка почвы для анализа. Образцы почвы освобождают от крупных включений, размельчают, просеивают через стерильное 3-миллиметровое сито, затем пробу почвы высыпают на стерильную бумагу, тщательно перемешивают и отвешивают 10 г. Навеску почвы помещают в колбу емкостью 250 см с 90 см стерильной водопроводной воды. Получают разведение 1:10, которое соответствует 0,1 г исследуемой почвы. Колбу встряхивают в течение 10 мин, дают отстояться грубым частицам почвы в течение 30 с и затем делают от 3 до 6 десятикратных разведений в зависимости от загрязненности почвы.

13.1. Определение микробного числа почвы

В две стерильные чашки Петри, слегка приоткрыв крышку, вносят по 1 см 3 10 -4 и 10 -5 разведений почвенной суспензии и затем заливают их расплавленным и охлажденным до 45 °С питательным агаром (МПА или картофельно-глюкозный агар). После застывания агара чашки помещают в термостат на 24-48 ч при температуре 37±2 °С, а затем выдерживают столько же при комнатной температуре. Подсчитывают число выросших на чашках колоний и определяют микробное число в 1 г почвы с учетом засеянного разведения.

13.2. Определение колититра почвы

Наличие бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о свежем фекальном загрязнении почвы. Титром кишечной палочки (колититр) называют наименьшее количество почвы (в г), в котором обнаруживаются кишечные палочки. Колииндексом почвы называют количество кишечных палочек в 1 г почвы.

Для определения колититра по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -5 засевают в пробирки со средой Кесслера, в которых находятся поплавки. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 ч, после чего отмечают накопление газа в поплавках.

13.3. Определение перфрингенс-титра почвы

Перфрингенс-титр — титр грамположительных облигатноанаэробных спорообразующих палочек, восстанавливающих сульфиты. Присутствие С. perfringens (споровых форм) свидетельствует о давнем фекальном загрязнении.

Для определения перфрингенс-титра используют железосульфитный агар (среда Вильсона-Блера). Обнаружение С. perfringens на этой среде основано на способности данного микроорганизма восстанавливать Na₂S₂O₃ до _Na2S, который, взаимодействуя с хлорным железом, приводит к образованию сернистого железа (FeS), имеющего черный цвет.

Пробирки с разведениями почвенной суспензии прогревают на водяной бане с температурой 80-85 °С в течение 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и засевают по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -4 в пробирки с расплавленной и охлажденной до 45 °С средой Вильсона-Блера. Вращением пробирки между ладонями почвенную суспензию равномерно распределяют в среде, после чего пробирки охлаждают в проточной водопроводной воде до застывания агара. Посевы инкубируют в течение 18-24 ч при температуре 43 °С. О наличии С. perfringens судят по росту черных колоний в пробирках со средой.

13.4. Определение количества термофильных микроорганизмов в почве

Для определения индекса термофильных бактерий в стерильные чашки Петри вносят по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -3 , заливают их расплавленным и охлажденным до 45 °С МПА. После застывания агара чашки инкубируют в течение 24 ч при температуре 60 °С, после чего подсчитывают число выросших колоний и определяют количество термофильных бактерий в 1 г почвы с учетом разведения.

13.5. Обнаружение в почве палочек протея

Бактерии рода Proteus попадают из почвы на пищевые продукты и при благоприятных условиях размножаются в них. Продукты жизнедеятельности палочек протея могут вызвать пищевое отравление.

Для обнаружения в почве палочек протея по методу Шукевича в конденсационную воду свежескошенного МПА вносят 0,1 см 3 соответствующего разведения почвенной суспензии. Пробирки выдерживают в течение 24-48 ч в термостате при температуре 37 °С, после чего регистрируют рост протеев по образованию тонкой вуалевидной пленки на скошенной поверхности агара. При наличии такой пленки готовят микроскопический препарат с ее поверхности, окрашивают его по Граму, определяют подвижность и способность образовывать H₂S.

Результаты санитарно-микробиологического исследования почвы анализируют и дают ей оценку, пользуясь данными, приведенными в табл. 13.1.

Таблица 13.1. Схема оценки санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям

Источник

Определение микробного числа почвы

Подготовка образца почвы для анализа

Порядок выполнения работы

Санитарно-микробиологическое исследование почвы

Цель работы – знакомство с методиками исследования микрофлоры почвы.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы включает определение титра санитарно-показательных микроорганизмов E. coli , Cl. perfringens, определение микробного числа почвы и поиск патогенных микроорганизмов.

В некоторых случаях проводится краткий анализ почвы, который включает определение микробного числа почвы и санитарно-показательных микроорганизмов. В полный анализ почвы дополнительно включают определение протея, обнаружение тифопаратифозных и дизентерийных возбудителей и поиски возбудителей раневых инфекций, термофильных анаэробов.

С выделенного участка почвы отбирают среднюю пробу, составленную из 5 образцов, взятых по диагонали участка или в четырех точках по краям и в одной в центре.

При проведении микробиологических исследований поверхностных слоев почвы образцы берут стерильным инструментом на глубине до 20 см. В тех случаях, когда желают изучить влияние загрязнений на санитарное состояние грунтовых вод и открытых водоемов, – на глубине 0,75 — 2 м.

Пробы отбирают в широкогорлые стерильные банки, каждый образец должен иметь массу 200 — 300 г, а смешанный образец не менее 1 кг.

Для установления эффективности обезвреживания нечистот и хозяйственно-бытовых отбросов образцы почвы следует отбирать на глубине 25 — 150 см, а при исследовании почвы кладбищ и скотомогильников – не менее чем на 25 см ниже глубины захоронения. Отбор проб почвы глубоких слоев производят буром Некрасова. Перед взятием нового образца почвы инструмент следует обмыть, обтереть спиртом и обжечь.

Отобранные пробы лучше исследовать в тот же день. Допускается хранение образцов почвы при температуре 1 — 5º не более 12 — 18 часов.

Образцы почвы освобождают от крупных включений, размельчают, просевают через стерильное 3-мм сито, затем пробу почвы тщательно перемешивают и отбирают 30 г и помещают в колбу емкостью 500мл с 270 мл стерильной воды. Колбу встряхивают 10 мин и из полученной суспензии без отстаивания приготовляют разведения: для чистой почвы 3-4 разведения, для загрязненной – 4-6 .

Микробное число почвы – это количество мезофильных аэробных и ф/анаэробных сапрофитных микроорганизмов, находящихся в 1 г почвы.

Для определения микробного числа почвы в санитарной микробиологии используют метод предельных разведений, предложенный Р. Кохом. Из каждой пробы почвы должно использоваться не менее 2-х различных разведений. Разведение готовят, отмывая микробы от частичек почвы в стерильной воде. При исследовании чистых почв засевают разведение 1:10 3 и 1:10 4 , грязных почв 1:10 5 и 1:10 6 . Для переноса суспензии каждого разведения в чашку Петри используют свежую стерильную пипетку. Допускается одной и той же пипеткой делать несколько посевов, но в этом случае посев следует начинать с большего разведения и переходить к меньшему (1:10 4 , 1:10 3 , 1:10 2 ). В стерильную чашку Петри, слегка приоткрыв крышку, вносят 1 мл почвенной суспензии соответствующего разведения. Затем в эту чашку в стерильных условиях вносят 15 мл остуженного до 45 0 С МПА или РПА, хорошо перемешивают круговыми движениями, закрытую чашку оставляют на горизонтальной плоскости для застывания агара.

При учете результатов число колоний. выросших на чашке, умножают на соответствующее разведение, объем пробы и пересчитывают на 1 г почвы. Чашки, на которых выросло мало колоний, во внимание не принимаются, так как случайное загрязнение их даже единичными микробами может дать существенную ошибку при последующих расчетах. Если выросло слишком большое количество колоний, то их не подсчитывают. В этих случаях повторяют исследование, сделав соответствующие поправки при посевах.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Источник

Показатели санитарного состояния почвы

Критерии санитарного состояния почвы. Микрофлора почвы.

В почве обитает очень много микроорганизмов, т.к. в почве имеются благоприятные условия для их жизнедеятельности (питательные вещества, вода, защищённость от солнечных лучей).

В почве обитают бактерии, грибы, лишайники, простейшие, бактериофаги, водоросли, вирусы.

Почвенные бактерии:

а) аммонифицирующие бактерии, которые разлагают белки (p. Pseudomonas, p. Proteus, p. Bacillus);

б) азотфиксирующие бактерии (p. Azotobacter, Azomonas, Mycobacter);

в) нитрифицирующие (p. Thiobacillus); г) клубеньковые (p. Rhizobium);

д) серо- и железобактерии.

Состав микрофлоры почвы зависит от плодородия почвы, рН, температуры, освещения, количества влаги, способов обработки почвы, времени года и других факторов. Больше всего микроорганизмов находится в культурной почве, на юге, летом, на глубине 10-20 см.

Вместе с испражнениями, мочой, с отбросами и трупами животных и человека в почву попадают представители нормальной микрофлоры человека и животных, патогенные и условно-патогенные микробы: кишечная палочка, Str. faecalis, возбудители брюшного тифа, сальмонеллёзов, дизентерии, возбудители холеры, клостридии газовой гангрены (C. Perfringens)..

В почве они через некоторое время погибают по различным причинам (недостаток питательных веществ, высыхания, действия света). Основная причина — антагонизм постоянных обитателей почвы (бактерий, актиномицетов, грибов).

Но некоторое время они сохраняются в почве. Сроки выживания – от нескольких дней до нескольких месяцев. Долго сохраняются в почве споры. Споры возбудителя сибирской язвы (Bac. anthracis), столбняка (Clostridium tetani), ботулизма (C. botulinum), газовой гангрены (C. perfringens и т.д.) сохраняются в почве в течение нескольких лет.

Таким образом, почва является фактором передачи инфекционных заболеваний. В связи с этим проводят санитарно-бактериологический контроль состояния почвы.

Оценка санитарного состояния почвы

Санитарно-показательными микроорганизмами почвы являются:

а) E. сoli (а также бактерии группы кишечной палочки (БГКП) — p. Citrobacter, p. Enterobacter, p. Klebsiella);

Эти бактерии имеют общий путь выведения с возбудителями кишечных инфекций (с фекалиями) и служат показателями фекальной загрязнённости почвы.

1. ОБЩЕЕ МИКРОБНОЕ ЧИСЛО (ОМЧ) ПОЧВЫ — общее количество микроорганизмов в 1 г почвы.

2. КОЛИ-ТИТР ПОЧВЫ, ПЕРФРИНГЕНС-ТИТР ПОЧВЫ и др. (оценивают количество санитарно-показательных микробов почвы).

КОЛИ-ТИТР ПОЧВЫ – наименьшее количество почвы в граммах, в котором определяется хоть одна жизнеспособная клетка кишечной палочки – E.coli.

ПЕРФРИНГЕНС-ТИТР ПОЧВЫ — наименьшее количество почвы в граммах, в котором определяется хоть одна жизнеспособная клетка возбудителя газовой гангрены — C. perfringens.

Методы определения.

1. Определение ОМЧ почвы:

а) посев 10-кратных разведений почвы (1:10, 1:100 и т.д.) в чашки Петри на МПА (для бактерий) и на сусло-агар или среду Сабуро (для грибов); посев можно делать в глубину (1 мл) или на поверхность (0,1 мл) среды;

б) инкубация посевов (48 час) при 24°С для грибов и при 37°С для бактерий;

в) подсчет числа колоний для каждого разведения;

в) расчет микробного числа почвы (с учетом навески почвы, разведения, объема посева), зная, что 1 колония – это 1 клетка.

2. Определение коли-титра почвы:

а) посев 10-кратных разведений почвы на жидкую среду Кесслера (содержит желчь, лактозу, пептон, генциановый фиолетовый, который подавляет рост многих микробов, кроме кишечной палочки);

б) инкубация при 37°С, 24 часа;

в) пересев положительных проб (образование газа и диффузное помутнение) на среду Эндо и инкубация при 37°С, 24 часа;

г) на среде Эндо E. coli образует тёмно-красные колонии с металлическим блеском; проводят микроскопическое подтверждение колоний E. coli (из подозрительной колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; под микроскопом видны мелкие грам»-» палочки);

д) расчет коли-титра (с учетом разведения и навески почвы определяют количество почвы в граммах, в котором обнаружена клетка кишечной палочки).

3. Определение перфрингенс-титра почвы:

а) почвенную суспензию прогревают 10-15 мин при 80°С для того, чтобы неспоровые бактерии не росли на среде;

б ) посев 10-кратных разведений почвы на среду Вильсона-Блера и инкубация при 37 — 43° С, 3-18час или посев на среду Тукаева (молочная среда) и инкубация 3 – 4 часа;

в) на среде Вильсона-Блера C. perfringens образует чёрные колонии и газ разрывает среду, а на среде Тукаева наблюдается створаживание молока, а газ разрывает сгустки казеина и вытесняет в верхнюю часть пробирки; наличие C. perfringens подтверждается микроскопически (готовят мазок, окрашивают по Грамму и микроскопируют, под микроскопом видны крупные грам «+» палочки)

г) расчет перфрингенс-титра (с учетом разведения определяют количество почвы в граммах, в котором обнаружена клетка C. perfringens).Перфрингенс-титр определяется максимальным разведением почвенной суспензии, при посеве которого образуются на среде Вильсона-Блера характерные черные колонии.

Нормативы по коли-титру и перфрингенс-титру почвы.

Вода – естественная среда обитания микроорганизмов. Состав микрофлоры воды зависят от химического состава воды, температуры, содержания CO₂ и O₂, рН, облучения солнечными лучами, содержания питательных веществ, флорой и фауной, глубиной водоёма, выпуском сточных и промышленных вод.

В пресных водоёмах (реки, озёра) нормальными обитателями являются Micrococcus roseus и др. микрококки, Pseudomonas fluorescens, извитые формы (Sp. rubrum). В воду поступают сапрофитные микробы почвы: p. Azotobacter, p. Nitrobacter, p. Proteus, p. Pseudomonas, p. Spirillum и др. Микробы воды участвуют в самоочищении водоемов. Они расщепляют органические вещества и делают их пригодными для усвоения другими организмами. Они являются также пищей для раков и моллюсков.

Больше всего микроорганизмов находится в придонных слоях, на дне, в прибрежной зоне (осенью и весной), т.к. на твердых частицах, в пористых материалах задерживаются питательные вещества. Чем больше органических веществ содержится в открытых водоёмах, тем у них более богатая микрофлора. В такой загрязненной органическими веществами воде можно обнаружить клостридии и другие анаэробы, увеличивается также количество аэробов (бактерий, вибрионов, спирохет). В водоёмах, богатых сероводородом, обитают фотосинтезирующие бактерии.

Таким образом, микрофлора рек и озёр определяется, в основном, степенью их биологического загрязнения, которое происходит при поступлении в водоемы сточных и промышленных вод. В большой степени она отражает микрофлору почвы около водоёма, т.к. микроорганизмы попадают в воду с частичками пыли, ливневыми, сточными, талыми водами. Микроорганизмы также попадают в водоёмы из организма рыб, гниющих растений, с отбросами и выделениями человека, животных, а также из воздуха.

В морях и океанах обитает меньшее количество микробов, чем в пресных водоемах. Это, в основном, солелюбивые (галофильные) и светящиеся микроорганизмы.

В воду могут попадать патогенные и условно-патогенные микробы из почвы, вместе со сточными и промышленными водами из населённых пунктов и плавающих судов, при стирке белья, купании лошадей, при попадании в воду трупов грызунов и других животных, погибших от инфекций.

Эти бактерии не приспособлены к существованию в воде и через некоторое время погибают. Но определенное время они сохраняются в воде: сальмонеллы – от 2 дней до 3 месяцев, шигеллы 5-9 дней, лептоспиры 7-150 дней, холерный вибрион до нескольких месяцев и даже может размножаться.

Таким образом, вода может быть фактором передачи инфекционных заболеваний (брюшного тифа и паратифа, дизентерии, сальмонеллёза, холеры, лептоспироза, полиомиелита, гепатита, туляремии). В связи с этим необходимо проводить санитарно-эпидемиологический контроль состояния воды.

Источник