Необходимые условия для выращивания микроорганизмов

Условия выращивания (культивирования) микроорганизмов

К важнейшим условиям выращивания микроорганизмов на питательных средах относятся температура, свет, аэрация среды.

4.4.1 Температура. Для оптимального развития микроорганизмов необходима температура, соответствующая видовым потребностям культуры. По отношению к температуре микроорганизмы подразделяются на холодолюбивые (психрофилы), среднетеплолюбивые (мезофилы) и теплолюбивые (термофилы).

Оптимальные температуры развития психрофилов составляет 6-10 о С, но некоторые могут развиваться и при температуре около 0 о С. Температурный оптимум для мезофилов составляет 25 — 30 о С, а термофилов 50-60 о С.

Большинство видов бактерий активно размножаются при температуре 30-37 о С, а мицеллиальные грибы – при 20-22 о С. При отклонении температуры от оптимальной развитие микроорганизмов задерживается. Поэтому для выращивания микроорганизмов используются специальные приборы – термошкафы с термоизоляцией, способные поддерживать постоянную температуру, соответствующую потребностям культур. Такие приборы называются термостатами.

4.4.2 Свет. Большинство микроорганизмов не нуждаются в свете, а прямые солнечные лучи подавляют их развитие. В связи с этим микроорганизмы выращивают в неосвещенных термостатах.

4.4.3 Аэрация. Потребности в свободном кислороде у микроорганизмов неодинаковы. Аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы выращивают в обычных условиях воздушной среды. Культивирование строгих анаэробов должно производиться в бескислородных условиях, которые создаются различными приемами.

Для культивирования анаэробов применяют:

а) специальные приборы – анаэростаты, из которых выкачивают воздух посредством насоса, а затем помещают в термостат;

б) эксикаторы, из которых воздух либо удаляется, либо заменяется инертным газом (азотом, водородом, диоксидом углерода);

в) аппарат Аристовского – герметически замкнутый сосуд, где происходит связывание кислорода воздуха с помощью химических соединений (щелочного раствора пирогаллола, металлического железа и т.д.);

г) выращивание микроорганизмов в жидкой среде – пробирке 10-15см 3 , залитой слоем стерильного индиффирентного (вазелинового) масла или парафина;

д) розливка среды в узкие пробирки высоким столбиком;

е) совместное выращивание анаэробов и аэробов, обильно поглощающих кислород в герметично залитой парафином чашке Петри.

4.4.4 Сроки культивирования. Большинство культур аэробных бактерий выращивают в течение 24-36ч, анаэробных – 36-72ч, плесневые грибы культивируют в течение недели.

4.4.5 Счет колоний. При небольшом количестве выросших колоний их считают методом прямого счета, с помощью лупы, отмечая сосчитанные колонии восковым карандашом. Для удобства чашки Петри можно разделить на равные сектора, подсчитать количество колоний в одном секторе и, перемножив это количество на число секторов, можно определить общее число колоний, выросших на чашке Петри. Если количество колоний велико и прямой счет их затруднителен, то можно применять специальные счетные камеры – аппарат Вольфюгеля, пластинки Лафара и др.

1) Подготовить пробирки, чашки Петри и пипетки к стерилизации.

2) Приготовить МПА из сухого питательного агара, разлить в пробирки, колбы и простерилизовать в автоклаве.

3) Приготовить агар-«столбик» и агар-«косячок» в пробирках.

4) Разлить МПА в чашки Петри.

5) Произвести посев «штрихом», «уколом» из пробирки в пробирку и посев «газоном» из пробирки в чашку Петри.

6) Оформить протокол исследования, схематически изобразив посев «штрихом», «уколом», «газоном», и представить способы стерилизации в виде следующей таблицы.

Таблица 2 — Способы стерилизации

К о н т р о л ь н ы е в о п р о с ы:

1) Что представляют собой питательные среды и каким требованиям они должны удовлетворять?

2) Классификация питательных сред.

3) Какие вещества и в каких концентрациях применяются в микробиологической практике для уплотнения питательных сред?

4) Что такое стерилизация и ее основные способы?

5) Что понимаем под термином «дробная» стерилизация и пригодна ли она для стерилизации стеклянной посуды? Обосновать.

6) Что в микробиологической практике называется посевом, пересевом микроорганизмов?

7) Методы посевов (пересевов) микроорганизмов.

8) Какие условия нужны для успешного выращивания микроорганизмов?

9) Способы культивирования анаэробов.

10) Назначение термостата в лаборатории микробиологии.

Источник

Условия культивирования бактерий

Для культивирования бактерий необходимо соблюдать ряд условий.

1.Наличие полноценной питательной среды. Каждая питательная среда независимо от сложности состава и цели применения должна обладать водной основой, органичес­ким источником углерода и энергии, опреде­ленным рН, осмотическим давлением.

2.Температура культивирования. Температура влияет на скорость размножения. К температу­ре бактерии относятся по-разному:

— мезофилы размножаются в диапазоне температур 20—40 °С. К мезофиллам относит­-
ся большинство болезнетворных для человека бактерий;

— термофилы растут в диапазоне температур 40—60 °С. К термофилам относятся актиномицеты, некоторые спороносные бациллы;

— психрофилы размножаются в диапазоне температур 0—20 °С.

3.Атмосфера культивирования. Для роста и размножения строгих аэробов необходим

кис­лород. Аэробы хорошо растут на поверхности агара на чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды. Для обеспечения роста и размножения строгих аэробов в глубинных сло­ях жидкой среды необходимо диффузное рас­пределение кислорода по всему объему пита­тельной среды. Это достигается непрерывным перемешиванием или встряхиванием питатель­ной среды, т. е. аэрированием. Аэрирование осуществляется на специальных аппаратах — встряхивателях.

Для культивирования факультативных ана­эробовиспользуют те же методы, так как в присутствии кислорода у них преобладает оксидативный метаболизм над ферментацией, как наиболее энергетически выгодный.

Микроаэрофилыразмножаются при пони­женном парциальном давлении кислорода. Этого можно достичь повышением в атмос­фере культивирования парциального дав­ления СО₂ до концентрации 1—5 % против 0,03 % СО₂ в атмосфере воздуха. Для этих же целей используют специальные СО₂-инкуба-торы, или же посевы помещают в эксикаторы, в которых устанавливают горящую свечу.

Облигатные анаэробыдля своего роста и размножения требуют исключения доступа кислорода воздуха. Это достигается следую­щими мерами:

—добавлением к питательным средам реду­цирующих кислород веществ: тиогликолевой
кислоты, аскорбиновой кислоты, цистеина, сульфидов;

—регенерацией от кислорода воздуха жидких питательных сред путем их кипячения с после­дующим плотным закупориванием сосудов, в которые налиты среды, резиновыми пробками;

—использование поглотителей кислорода, щелочного пирогаллола, и других, помещая
их в герметически закрываемые емкости «газ-паки». Этот метод используется для культиви­-
рования аэротолерантных бактерий;

—механическим удалением кислорода воз­духа с последующим заполнением емкости
инертным газом (для этих целей используют анаэростаты и анаэробные боксы).

Для культивирования хемо- и фотоавтотрофных бактерий создается атмосфера, насы­щенная СО₂.

4.Время культивирования. Зависит от вре­мени генерации. Большинство бактерий куль­тивируют для получения видимого роста в течение 18—48 ч. Для культивирования возбу­дителя коклюша требуется 5 суток, а для куль­тивирования М. tuberculosis — 3—4 недели.

Культивирование абсолютных внутрикле­точных паразитов, бактерий, относящихся к родам Rickettsia, Ehrlichia, Coxiella, Chlamydia, осуществляют на культурах клеток или в ор­ганизме животных и членистоногих, а также в куриных эмбрионах (за исключением эрлихий). Куриные эмбрионы используют также для культивирования бактерий, обладающих высоким уровнем гетеротрофное™, напри­мер: родов Borrelia, Legionella.

В промышленных условиях для получения биомассы бактерий или грибов с целью по­лучения антибиотиков, вакцин, диагности­ческих препаратов, пробиотиков культивиро­вание осуществляется в аппаратах (фермен­терах) различной вместимости при строгом соблюдении оптимальных параметров роста и размножения культур.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Источник

Современный подход к культивированию микроорганизмов и культур клеток

Большинство научных исследований в области биологии и медицины проводятся не на живых организмах, а «в пробирке». Клеточные культуры и культуры микроорганизмов являются наиболее простым и удобным модельным объектом, позволяющим как тестировать на них воздействие извне, так и исправлять ошибки внутри клетки. Благодаря исследованиям в области клеточного редактирования постепенно становится возможным лечение многих генетических заболеваний. Но каким образом мы можем добиться культуры, максимально соответствующей требованиям к модели для сложных экспериментов? Рассмотрим наиболее популярные современные способы выращивания микроорганизмов и культур клеток.

Общее понимание культивирования

Культивирование как микроорганизмов, так и отдельных клеток – это выращивание изъятого из определенной среды материала в лабораторных условиях. Выращенная таким образом подборка единообразных микробов или клеток уже может называться культурой.

Для того, чтобы выращивание прошло успешно, требуется наличие определенного оборудования, а также соблюдение условий, необходимых для роста и созревания культуры. Стандартно для культивирования используются:

• Питательная среда, на которой будущая культура должна расти.
• Факторы роста – питательные вещества, используемые клетками.
• Посуда, включающая в себя стерильные чашки Петри, инструменты для переноса клеток на среду и др.
• Дополнительное оборудование: термостаты, аппараты для ферментации и другие.

Также в процессе культивирования от лаборатории требуется соблюдение условий роста для каждой конкретной культуры. Ввиду того, что как клетки, так и микробы, требуют для себя условий, приближенных к естественным, в лаборатории должны поддерживаться различные условия роста при наличии разных культур. Основные условия: приемлемая для культур температура, влажность, давление, постоянная подача кислорода (для аэробных бактерий) или исключение доступа к кислороду (для анаэробных). (Рекомендуем статью: «Флуоресцентная микроскопия»)

Факторы роста

Факторами роста называют все питательные вещества, которые требуются бактериям и клеткам для оптимального роста и развития. В случае если сама среда не обладает достаточным количеством нужных элементов, их добавляют извне. При этом количество строго регулируется в зависимости от требований к конечной культуре.

К наиболее часто использующимся в современном лабораторном культивировании факторам роста относятся:

• Аминокислоты. Отдельным микроорганизмам или группам клеток требуются дополнительные аминокислоты извне. При этом требоваться может только одна кислота, например, лейцин и аргинин для стрептококков.
• Пуриновые или пиримидиновые основания. Также используются и их производные (аденин, гуанин и др.).
• Витамины. Они требуются для того, чтобы поддерживать работу коферментов, участвующих в метаболизме как клеток, так и бактерий.

В зависимости от типа культивируемых клеток или бактерий, фактор роста может как входить в состав питательной среды, так и вноситься извне.

Питательные среды и требования к ним

Питательная среда – это пространство, в котором находится необходимая группа клеток или бактерий. Среды бывают очень разными, в том числе и узкоспециализированными, для роста наиболее привередливых микроорганизмов. Однако существуют и общие требования, предъявляемые ко всем средам без исключения:

1. Питательность. Среда должна содержать все необходимые вещества, которые используются бактериями для роста и не могут быть синтезированы ими без среды.
2. Нужный уровень pH. Это требуется для регулирования проницаемости мембраны клетки и, как следствие, уровень питательных веществ, попадающих внутрь.
3. Уровень осмотического давления, равный уровню давления в культивируемой клетке.
4. Оптимальный для конкретной бактерии уровень влажности.
5. Окислительно-восстановительные качества. Наибольшие различия требований по данной характеристике существуют при культивировании аэробов и анаэробов.
6. Единый состав среды. Каждая конкретная среда должна иметь одинаковое количество веществ, чтобы не было вариативности в результатах культивирования.

При этом питательные среды могут значительно различаться по всем остальным характеристикам. Они могут быть как натуральными, так и синтезированными искусственно, а также жидкими, полужидкими или плотными.

Условия роста

Рост микроорганизмов и клеток невозможен без соблюдения определенных условий, таких как температура, влажность, давление, свет и аэрация (насыщение кислородом). Существуют микроорганизмы, которые имеют диаметрально противоположные требования по условиям роста. Для решения проблемы условий при культивировании различных клеток или микроорганизмов используется специальная аппаратура с камерами, внутри которых поддерживается нужный уровень температуры, света или давления. В одном таком устройстве, но в разных камерах, может быть одновременно несколько чашек Петри с материалом, имеющим различные требования по условиям роста. (Рекомендуем статью: «Инновационные технологии для поиска и разработки новых лекарств»)

Стерилизация посуды, сред и окружения

Одним из наиболее важных требований к процессу культивирования, является отсутствие загрязнений на оборудовании, при помощи которого происходит выращивание. Этого добиваются, проводя мероприятия по стерилизации. Стерилизация может проводиться несколькими способами, наиболее известные и используемые в современных лабораториях:

• Прокаливание. Экспресс-метод устранения микробиологического загрязнения через нагрев, может выполняться на спиртовке. Однако данный метод не может быть использован с чем-то, кроме игл и петель для переноса материала.
• Кипячение. Данный метод широко используется для устранения микробов, но споры бактерий он не устраняет.
• Сухожаровая стерилизация. Проводится в сушильном шкафу, наиболее часто используется для лабораторной посуды.
• Автоклавирование под давлением. Один из самых популярных и универсальных методов, однако многие материалы и среды разрушаются при использовании автоклавов.

Основным моментом в современном культивировании клеток и микроорганизмов, всегда будет являться неуниверсальность методик. Из-за большого разнообразия объектов культивирования, всегда будет необходимость подбирать наилучшие условия для конкретного объекта.

Источник