Определение микробиологических показателей почвы

ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I — Л. В. Красникова — 2016

13. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЧВЫ

Цель работы: провести микробиологическое исследование почвы как источника контаминации пищевых продуктов посторонними микроорганизмами.

Почва обильно заселена микроорганизмами. В ней встречаются все формы микроорганизмов, которые существуют на Земле: бактерии, вирусы, актиномицеты, дрожжи, грибы, простейшие. Общее микробное число (ОМЧ) в 1 г почвы может достигать от 1,0 до 10 млрд. В разных слоях почвы количество микроорганизмов неодинаково. В самом верхнем слое (0,5 см) микроорганизмов очень мало. На глубине от 1-5 см до 30-40 см число микроорганизмов максимально — в среднем от 10 до 50 млн в 1 г. После 30-40 см глубины ОМЧ постепенно снижается и в более глубоких слоях оно минимально.

Микрофлору почвы делят на 2 группы:

1) аутотрофная — питается минеральными веществами;

2) гетеротрофная — питается органическими веществами.

Обе группы участвуют в процессах самоочищения почв, их минерализации. Однако в группе гетеротрофных микроорганизмов может присутствовать патогенная микрофлора. При загрязнении почвы фекалиями людей, больных кишечными инфекциями, продукты растительного происхождения могут быть контаминированы возбудителями дизентерии, холеры, брюшного тифа, сальмонеллеза, энтеровирусами. Установлена прямая зависимость между уровнем заболеваемости человека и животных кишечными инфекциями и неудовлетворительным санитарным состоянием почвы. Через почву передаются возбудители таких инфекционных заболеваний, как сибирская язва, газовая гангрена, столбняк и др.

При санитарно-микробиологическом анализе почвы определяют общее микробное число, колититр, перфрингенс-титр, титр нитрифицирующих бактерий и количество протеев и термофильных бактерий. Микробное число характеризует загрязненность почвы органическими веществами. Присутствие в почве бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о ее фекальном загрязнении. Обнаружение в почве палочки Clostridium perfringens также указывает на ее фекальное загрязнение. Наличие в почве бактерий рода Proteus дает основание считать возможным загрязнение почвы органическими веществами животного происхождения или фекалиями человека. Присутствие термофильных микроорганизмов указывает на загрязнение почвы навозом или компостами. В чистых почвах термофильные микроорганизмы, как правило, не обнаруживаются.

Взятие проб почвы. При проведении микробиологических исследований поверхностных слоев почвы образцы берут на глубине 15-20 см, снимая верхний слой толщиной 2 см (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб). Отбирают пробы маленькой железной лопаткой или совком в стерильные широкогорлые банки, завернутые в бумагу и снабженные этикеткой. Каждый взятый образец должен весить 200-300 г, а смешанный образец (средняя проба) — не менее 1 кг.

Подготовка почвы для анализа. Образцы почвы освобождают от крупных включений, размельчают, просеивают через стерильное 3-миллиметровое сито, затем пробу почвы высыпают на стерильную бумагу, тщательно перемешивают и отвешивают 10 г. Навеску почвы помещают в колбу емкостью 250 см с 90 см стерильной водопроводной воды. Получают разведение 1:10, которое соответствует 0,1 г исследуемой почвы. Колбу встряхивают в течение 10 мин, дают отстояться грубым частицам почвы в течение 30 с и затем делают от 3 до 6 десятикратных разведений в зависимости от загрязненности почвы.

13.1. Определение микробного числа почвы

В две стерильные чашки Петри, слегка приоткрыв крышку, вносят по 1 см 3 10 -4 и 10 -5 разведений почвенной суспензии и затем заливают их расплавленным и охлажденным до 45 °С питательным агаром (МПА или картофельно-глюкозный агар). После застывания агара чашки помещают в термостат на 24-48 ч при температуре 37±2 °С, а затем выдерживают столько же при комнатной температуре. Подсчитывают число выросших на чашках колоний и определяют микробное число в 1 г почвы с учетом засеянного разведения.

13.2. Определение колититра почвы

Наличие бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о свежем фекальном загрязнении почвы. Титром кишечной палочки (колититр) называют наименьшее количество почвы (в г), в котором обнаруживаются кишечные палочки. Колииндексом почвы называют количество кишечных палочек в 1 г почвы.

Для определения колититра по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -5 засевают в пробирки со средой Кесслера, в которых находятся поплавки. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 ч, после чего отмечают накопление газа в поплавках.

13.3. Определение перфрингенс-титра почвы

Перфрингенс-титр — титр грамположительных облигатноанаэробных спорообразующих палочек, восстанавливающих сульфиты. Присутствие С. perfringens (споровых форм) свидетельствует о давнем фекальном загрязнении.

Для определения перфрингенс-титра используют железосульфитный агар (среда Вильсона-Блера). Обнаружение С. perfringens на этой среде основано на способности данного микроорганизма восстанавливать Na₂S₂O₃ до _Na2S, который, взаимодействуя с хлорным железом, приводит к образованию сернистого железа (FeS), имеющего черный цвет.

Пробирки с разведениями почвенной суспензии прогревают на водяной бане с температурой 80-85 °С в течение 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и засевают по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -4 в пробирки с расплавленной и охлажденной до 45 °С средой Вильсона-Блера. Вращением пробирки между ладонями почвенную суспензию равномерно распределяют в среде, после чего пробирки охлаждают в проточной водопроводной воде до застывания агара. Посевы инкубируют в течение 18-24 ч при температуре 43 °С. О наличии С. perfringens судят по росту черных колоний в пробирках со средой.

13.4. Определение количества термофильных микроорганизмов в почве

Для определения индекса термофильных бактерий в стерильные чашки Петри вносят по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -3 , заливают их расплавленным и охлажденным до 45 °С МПА. После застывания агара чашки инкубируют в течение 24 ч при температуре 60 °С, после чего подсчитывают число выросших колоний и определяют количество термофильных бактерий в 1 г почвы с учетом разведения.

13.5. Обнаружение в почве палочек протея

Бактерии рода Proteus попадают из почвы на пищевые продукты и при благоприятных условиях размножаются в них. Продукты жизнедеятельности палочек протея могут вызвать пищевое отравление.

Для обнаружения в почве палочек протея по методу Шукевича в конденсационную воду свежескошенного МПА вносят 0,1 см 3 соответствующего разведения почвенной суспензии. Пробирки выдерживают в течение 24-48 ч в термостате при температуре 37 °С, после чего регистрируют рост протеев по образованию тонкой вуалевидной пленки на скошенной поверхности агара. При наличии такой пленки готовят микроскопический препарат с ее поверхности, окрашивают его по Граму, определяют подвижность и способность образовывать H₂S.

Результаты санитарно-микробиологического исследования почвы анализируют и дают ей оценку, пользуясь данными, приведенными в табл. 13.1.

Таблица 13.1. Схема оценки санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям

Источник

Санитарная оценка почвы по микробиологическим показателям.

При санитарной оценке почвы учитывают результаты химического, микробиологического и гельминтологического исследований.

Микробиологическое исследованиепроводят для санитарной оценки почвы, характеристики процессов самоочищения, оценки почвенного и биотермического методов обезвреживания отбросов, при определении пригодности участков для строительства, а также при эпидемиологических и эпизоотологических обследованиях с целью выяснения путей заражения почвы, продолжительности выживания в ней патогенных микробов и т. д. В зависимости от поставленной задачи применяют краткий или полный санитарно-бактериологический анализ почвы.

Краткий анализ почвывключает определение двух микробиологических показателей: микробного числа (общего количества бактерий) и коли-титра.

Полный анализвключает определение микробного числа, коли-титра, титра анаэробов (Cl. Perfringens), протея, термофилов.

Микробиологическим показателем, характеризующим загрязненность почвы органическими веществами, является микробное число. В чистых почвах микробное число не превышает 1-1,5 млн. особей в 1г, сильно загрязненных почвах того же типа микробов возрастает в несколько раз (таблица).

Таблица — Показатели загрязненности почвы

Санитарное значение микробного числа почвы нельзя рассматривать без учета особенностей различных типов почвы. Например, черноземные почвы содержат значительно больше микроорганизмов, чем подзолистые. Поэтому при определении общего количества бактерий в почве необходимо полученные результаты сравнивать с микробным числом незагрязненных почв того же типа.

Исследование на прямое обнаружение патогенных микробов в почве проводят только при специальных показаниях. В качестве косвенных показателей возможного загрязнения почвы патогенными бактериями используют санитарно-показательные микроорганизмы: бактерии группы кишечных палочек, Cl. Perfringens, бактерии из рода Proteus , термофилы.

Наличие в почве бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о ее фекальном загрязнении. В загрязненных участках почвы коли-титр составляет 1×10-3-1⋅10 -5 , тогда как в чистых почвах коли-титр может быть равен 1 и выше.

Обнаружение Cl. Perfringens в почве также указывает на ее фекальное загрязнение. Почвенных слой обогащается одновременно бактериями группы кишечных палочек и Cl. Perfringens. Через 4-5 месяцев отмечается отмирание кишечных палочек, а Cl. Perfringens еще обнаруживается в титре 0,01. Следовательно, Cl. Perfringens имеет санитарно-показательное значение только в том случае, если титр определяют в комплексе с коли-титром и другими показателями. Свежее или давнее фекальное загрязнение почвы можно определить по соотношению количества вегетативных форм Cl. Perfringens и споровых форм микроба.

Выявление в почве бактерий рода Proteus свидетельствует о загрязнении ее органическими веществами животного происхождения или фекалиями людей. Термофильные микроорганизмы являются показателями загрязнения почвы навозом, компостами. В чистых почвах термофилов не обнаруживают.

Методы определения состава и активности почвенных микроорганизмов.

Для оценки деятельности почвенной биоты используют показатель биологической активности почвы. Биологическую активность почвыопределяют следующими способами:

— подсчетом общего количества почвенных микроорганизмов.В связи с несовершенством методик этот метод определения дает условную, примерную характеристику биологической активности почвы.

— определением количества отдельных физиологических группмикроорганизмов, например, нитрифицирующих или целлюлозлразрушающих бактерий.

— определение выделяемого почвой диоксида углерода — основной биохимический способ определения биологической активности почвы. Чем интенсивнее выделение углекислого газа из почвы, тем активнее происходит в ней биологические процессы, тем лучше условия для возделывания культур и выше их потенциальная урожайность.

Выделение углекислого газа из почвы в приземный слой атмосферы называют дыхание почвы.Интенсивность дыхания почвы зависит от ее свойств, гидротермических условий, характера растительности, агротехнических мероприятий. Выделение диоксида углерода почвой усиливается при ее окультуренности в связи с активизацией биологических процессов и улучшением условий аэрации. Уменьшение выделения углекислого газа почвой (снижение биологической активности) может ухудшить поступление кислорода в почву, что, в свою очередь, будет способствовать образованию токсичных веществ.

Для санитарной оценки почвыисследуют пробы с целью обнаружения патогенных микробов. Для адекватной оценки почвы особую значимость имеет выбор индикаторных микроорганизмов.

Оценка фекального загрязненияпочвы и его давности проводится по следующим показателям:

— по индексу БГКП (количество бактерий группы кишечной палочки — БГКП в 1 г почвы)

— по перфрингенс титру (гаименьшее количество почвы, в котором обнаруживается Cl. Perfringens)

— по титру эктерококков

Параллельно определяют микробное число почвы.

Загрязненность почвы навозом и компостомоценивается по титру термофилов — бактерий, вырастающих на мясо — пентоном агаре при 60 о С в течение 24 часов.

К СПМ (санитарно-показательные микроорганизмы), указывающим на фекальное загрязнение почвы, относят БГКП (бактерии группы кишечной палочки), Cl. Perfringens , термофильные бактерии и нитрифицирующие бактерии (таблица).

Таблица — Показатели чистоты почв по СПМ

Из всех эктеробактерий наиболее долго сохраняется в почве кишечная палочка, поэтому по ее содержанию судят о наличии в почве прочих энтеробактерий.

Термофильные бактерии попадают в почву с перепревшим навозом или компостом, поэтому их целесообразно выявлять для выяснения характера и давности органического загрязнения почвы. Свежий навоз, сточные воды обычно содержат много БГКП, но мало термофильных бактерий. По мере разложения органических веществ количество термофилов увеличивается.

Появление нитрифицирующих бактерий (нитрификаторов) указывает на развитие процесса самоочищения, так как они завершают цикл разложения азотсодержащих соединений, превращая аммиак в азот. При свежем фекальном загрязнении нитрификаторов не будет, поскольку субстрат для их развития отсутствует. В ходе жизнедеятельности микроорганизмов, разлагающих органические вещества, образуется аммиак, что приводит к развитию нитрификаторов.

На свежее фекальное загрязнение почвы указывают высокие титры БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое содержание вегетативных форм Cl. Perfringens.

Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели.

Цели санитарно-микробиологического исследования почвы:

— санитарная оценка почвы населенных пунктов и новых участков для заселения и размещения зданий

— решение вопросов водоснабжения, канализации и очистки населенных пунктов

— санитарная оценка почвы, загрязненной химическими веществами

— контроль процессов самоочищения почвы, подвергавшейся биологическому загрязнению

-эпидемиологическое обследование почвы для выяснения путей ее заражения.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы в зависимости от целей исследования предполагает краткий и полный анализ. Отбор проб производят с квадратного участка (не менее 5×5 м). образцы забирают с глубины 20-30 см из каждого угла и центра квадрата. Объем образцов 1 кг.

Краткий санитарно-микробиологический анализпредусматривает определение ОМЧ (общее микробное число), титров БГКП, энтерококков, Cl. Perfringens, термофильных бактерий, нитрифицирующих бактерий. Полученные результаты указывают на наличие и степень фекального загрязнения. Краткий анализ почвы осуществляют при проведении текущего санитарного надзора за состоянием почвы.

Полный санитарно-микробиологический анализвключает определение всех показателей краткого анализа, а также общей численности сапрофитов, ОМЧ и процентного содержания споровых микроорганизмов, аэробных бактерий, разрушающих клеткатку, бактерий-аммонификаторов. Кроме того, исследуют токсичность почв для микроорганизмов. Полный анализ проводят при осуществлении предупредительного санитарного надзора, первичном обследовании при выборе территории для размещения отдельных объектов.

Периодичность контроля.Периодичность контроля зависит от контролируемых объектов (детские сады -не менее 2 раз в год), но не реже 1 раза в год. При изучении динамики самоочищения почвы на загрязненных территориях пробы берут в течении первого месяца после загрязнения еженедельно, в последующие месяцы — 1 раз в месяц в течение вегетационного периода до завершения активной фазы самоочищения.

Методы проведениясанитарно-микробиологических исследований:

— методы прямого обнаружения патогенных микроорганизмов (посев исследуемого материала на питательные среды)

— методы косвенной идентификации (определение общего микробного числа — ОМЧ и определение содержания санитарно-показательных микроорганизмов — СПМ методом подсчета количества бактерий с помощью счетчиков, а также методом посева на питательные среды).

Титр СПМ — наименьший объем исследуемого материала (в мл) или весовое количество (в г), в котором обнаружена хотя бы одна особь СПМ.

Индекс СПМ — количество СПМ, обнаруженных в определенном объеме или количестве исследуемого объекта. Индекс — величина, обратная титру.

Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначен­ные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Источник