XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум — 2019
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИТОТОКСИЧНОСТИ ПОЧВ МЕТОДОМ БИОТЕСТИРОВАНИЯ
Применяемые в настоящее время методы химического, физического и санитарно-микробиологического анализа не могут дать полной оценки воздействия человека на окружающую среду. Данные методы отражают ситуацию непосредственного в период взятия проб, методы биологического тестирования позволяют обнаружить воздействия на объекты окружающей среды предшествующие времени анализа. Кроме того, биологические объекты реагируют на все виды загрязнителей независимо от их природы и дают общий интегральный показатель качества природной среды или некоторых её компонентов.
Основными источниками загрязнения атмосферного воздуха и почвы являются нефте- и газоперерабатывающие заводы, авто- и железнодорожный транспорт. В черте городов в атмосферу выбрасываются токсиканты, концентрации которых зачастую превышают предельно допустимые – это оксиды азота и серы, сероводород, тяжёлые металлы, выбросы твердых частиц. Почва, как депонирующий фактор городской среды, отражает длительность и интенсивность воздействия загрязняющих веществ. Например, загрязнение почв нефтью, её фракциями, а также продуктами переработки нарушает стабильное функционирование экосистемы вследствие этого меняются физико-химические свойства почвы, активность основных ферментов, участвующих в биологических процессах.
Методы биотестирования дают возможность охарактеризовать степень воздействия изучаемого фактора на биоценозы и природные среды.
Цель исследования: определение фитотоксичности почв, отобранных с участков, подвергающихся различному уровню техногенного загрязнения.
Исследование построено на биотестировании различных образцов почв, с определением их фитотоксичности методом проростков растения семейства крестоцветные ( Brassicaceae ) – клоповника посевного ( Lepidium sativum , L ). Это однолетнее, травянистое растение, относящееся к группе растений-биоиндикаторов. Выбранное растение характеризуется хорошей всхожестью, достаточно быстрым ростом и реакцией на изменяющиеся условия среды обитания.
Фитотоксичность – свойство почвы, обусловленное наличием загрязняющих веществ и токсинов, подавлять рост и развитие высших растений. Достоинствами метода определения фитотоксичности являются его простота, оперативность и достаточно хорошая воспроизводимость.
Объект и методы исследования. Семена клоповника посевного ( Lepidium sativum , L ) были собраны и сохранялись в бумажных пакетах. Специальной обработки семян (стратификация, скарификация) не проводилось. Отобранные для опыта в количестве по 100 штук семена высевались равномерно в 10 рядов по 10 штук в каждом в пластиковые контейнеры с почвой исследуемых участков. Контейнер с контрольным образцом почвы: грунт «Универсальный», предназначенный для посева цветочных и овощных культур (со слабокислой реакцией среды) и 3 контейнера с почвой разных частей города Оренбурга – первый участок «Промышленный район близ железнодорожных путей», второй участок – «пойма р. Урал», третий участок — «Очистные сооружения г. Оренбурга». Проращивание проводили при температуре 20–25 °С в течение 4–х суток. Далее проростки извлекались из почвы, отделялись от земли, просушивались, с проростком стряхивали остатки почвы и измеряли морфофизиологические признаки: окончательную длину всего растения, длину корней (отдельно) и длину наземной части растений (отдельно). Затем определяли энергию прорастание семян в %, фитотоксичность почв и класс токсичности почв.
Результаты и их обсуждение. Растительность как биотический компонент любой природной экосистемы играет решающую роль в структурно-функциональной организации экосистемы и определении ее границ. Растения чувствительны к нарушениям окружающей среды и наиболее наглядно отражают изменения экологической обстановки территории в результате антропогенного воздействия. Результаты проведённого исследования показывают, что все образцы почвы, отобранные с 3-х участков относятся к третьему классу фитотоксичности, значение которой варьирует от 0,51 до 0,59 и характеризуется как среднее. Для всех образцов зафиксирована достаточно высокая энергия прорастания, составляющая в среднем 84,3%, наибольшая отмечена для участка «Очистные сооружения г. Оренбурга» и составляет 90%, наименьшая энергия прорастания зафиксирована для образца почвы с участка «Промышленный район близ железнодорожных путей», составляет 76%. Для данного участка отмечена гибель 1,5% растений на 2 – 3 день после всходов, что, по-видимому, может быть обусловлено присутствием в почве фитотоксикантов. Показатели длины надземной и подземной частей проростков в среднем по всем участкам составляли 3,9 см, однако длина надземной части в основном преобладала в сравнении с контролем в среднем в 1,6 раза, что может свидетельствовать о тормозящем эффекте исследуемых образцов почв на рост клоповника посевного ( Lepidium sativum , L ), связанном или с особенностями структуры почвы, или с воздействием веществ, содержащихся в ней.
Таким образом, результаты эксперимента показывают, что растения могут повреждаться и гибнуть от загрязнителей в почве. В образцах почв всех взятых для анализа участков зафиксирована фитотоксичность, что свидетельствует о неблагоприятном состоянии почвенной среды города и прилежащих территорий. Следовательно, токсиканты, поступающие в воздух при выпадение осадков аккумулируются и, по-видимому, обладают длительным токсическим действием в отношении растений. В связи с этим, например, при выборе видов деревьев, кустарников и трав для озеленения городских территорий следует учитывать экологические требования, использовать растения, способные выдержать максимальные нагрузки, предусматривать проведение специальных работ по уходу за растениями. Необходимо четко определять порог устойчивости отдельных участков зеленых насаждений к различным видам антропогенных нагрузок.
Выражаем благодарность научному руководителю ст. преподавателю кафедры биологии Оренбургского государственного медицинского университета Т.В. Осинкиной за помощь в проведении данного исследования.
Источник
Определение токсичности почв методом биотестирования
Определение интегральной токсичности почв с помощью биотеста «Эколюм»
1. Методические рекомендации разработаны: ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (Ревазова Ю.А., Донерьян Л.Г.), Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова (Данилов B.C.), ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора (Брагина И.В, Ластенко Н.С., Федосеева Т.А).
2. С выходом настоящих методических рекомендаций утрачивают силу методические рекомендации «Определение общей токсичности почв с помощью бактериального теста «Эколюм» от 8 июня 2000 г. МР N 11-134-09.
УТВЕРЖДЕНЫ Главным врачом ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека», Председателем Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И.Верещагиным 15 июня 2007 г.
1. Назначение и область применения
Настоящий документ устанавливает методику быстрого и количественного контроля степени интегральной химической токсичности водных вытяжек из почвы. Тест-система представлена биосенсорами серии «Эколюм» и измерительным прибором серии «Биотокс-10». Тест-система реагирует на токсичные соединения разнообразной химической природы и смеси веществ.
Документ предназначен для учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор.
Опасность загрязнения почв определяется уровнем ее возможного отрицательного влияния на контактирующие среды (вода, воздух), пищевые продукты и прямо или косвенно на человека.
Результаты обследования учитывают при определении и прогнозе степени опасности почв для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах, разработке мероприятий по их рекультивации, технических решений по реабилитации и охране территорий, оценке эффективности санитарно-экологических мероприятий и текущего санитарно-эпидемиологического надзора за объектами, воздействующими на окружающую среду населенного пункта.
2. Нормативные ссылки
3. ГОСТ 27793-88* (СТ СЭВ 5298-85) «Почвы. Термины и определения».
_______________
* Вероятно ошибка оригинала. Следует читать ГОСТ 25793-88, здесь и далее по тексту. — Примечание изготовителя базы данных.
4. ГОСТ 17.2.2.01-81* (СТ СЭВ 4470-84) «Охрана природы. Почвы. Номенклатура показателей санитарного состояния».
* Вероятно ошибка оригинала. Следует читать ГОСТ 17.4.2.01-81 , здесь и далее по тексту. — Примечание изготовителя базы данных.
5. ГОСТ 17.4.3.01-83 «Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб».
6. ГОСТ 17.4.3.03-85 «Охрана природы. Почвы. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ».
7. ГОСТ 17.4.4.02-84 «Охрана природы. Почва. Методы отбора и подготовки проб почвы для химического, бактериологического и гельминтологического анализа».
8. ГОСТ 17.4.3.06-86 (СТ СЭВ 5101-85) «Охрана природы. Почвы. Общие требования к классификации почв по влиянию на них химических загрязняющих веществ».
3. Термины и определения
Санитарно-гигиенический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением гигиенических нормативов качества окружающей среды.
Химическое загрязнение почвы — изменение химического состава почвы, возникшее под прямым или косвенным воздействием антропогенного фактора (промышленного, сельскохозяйственного, коммунального и т.п.), вызывающее снижение ее качества и возможную опасность для здоровья человека.
Фоновые почвы — почвы территорий, не подвергающихся техногенному воздействию или испытывающих его в минимальной степени.
Токсичность — степень проявления вредного действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность — один из важных факторов, определяющих качество окружающей среды, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности объектов при их использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе.
Критерий токсичности (индекс токсичности) — достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности изучаемого объекта. Среди тест-параметров наиболее часто используют выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.
Тест-реакция — это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или другого функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.
Биотестирование — проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.
Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемом объекте, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.
Биолюминесценция — интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.
4. Принцип методики
Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции биосенсора при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.
При изучении токсикологических свойств объектов окружающей среды люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на животных, культуры клеток человека и другие известные биотесты.
Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с контролем. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.
5. Количественная оценка параметров тест-реакции
Токсическое действие исследуемой пробы на тест-объект определяется по уменьшению интенсивности биолюминесценции за 30-ти минутный (в экспрессном варианте — 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины — индекса токсичности » » и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.
Индекс токсичности » «, равный отношению 
, где и соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с биосенсором.
Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения и , позволяют быстро и экономно выяснить вопрос при каких объемах исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее ЕС20).
ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением — концентрация), вызывающий тушение свечения биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс токсичности равен 50). ЕС20 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением — концентрация), который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец имеет допустимую степень токсичности.
Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция (G) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой 
, где и соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец сильно токсичен. График -функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте.
Люминометр «Биотокс-10» автоматически вычисляет величину индекса токсичности и параметры ЕС20 и ЕС50.
Методика предусматривает три пороговых уровня индекса токсичности:
— допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности меньше 20; объем пробы или концентрация вещества в пробе меньше величины ЕС20;
— образец токсичен: индекс равен или больше 20 и меньше 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) меньше величины ЕС50 и больше или равен ЕС20;
— острая токсичность образца: индекс токсичности равен или более 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) равен или больше величины ЕС50.
6. Оборудование, материалы, реактивы
1. Лиофилизированный биосенсор «Эколюм», ТУ 2639-236-00209792-01;
2. Прибор серии «Биотокс-10», сертификат об утверждении типа средств измерений RU.C.31,003.A N 21703, с набором кювет для измерения биолюминесценции объемом 1,5 мл;
3. Весы лабораторные общего назначения. ГОСТ 24104;
4. рН-метр, ГОСТ 25.7416.0171 или аналоги;
5. Термометр лабораторный 0-55 °С, цена деления шкалы — 0,5 °С, ГОСТ 215;
6. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474;
7. Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-18±1 °С) и хранение проб (2-4 °С);
8. Часы сигнальные, ТУ 25-07-57;
9. Подставка (из пластика, дерева) с углублением для пенициллиновых пузырьков или измерительных кювет, на которой можно разместить не менее 12 кювет;
10. Буры почвенные, ножи почвенные, ГОСТ 2307;
12. Бумажные фильтры обеззоленные типа ФОБ (красная, белая ленты), ТУ 6-09-1678;
13. Пипетки автоматические дозаторы любого типа объемом 0,02-0,5 мл ±1,0%;
14. Цилиндры вместимостью 25, 50 мл второго класса точности, ГОСТ 1770;
15. Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 10, 50 мл, ГОСТ 25336;
16. Пипетки объемом 0,5 и 1,0 мл, ГОСТ 29227;
17. Пробоотборник любого типа, объемом не менее 5 мл;
18. Флаконы и банки стеклянные с навинчивающейся крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 10, 50, 100 мл;
19. Воронки лабораторные, ГОСТ 25336;
20. Стаканчики для взвешивания (бюксы) диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148;
Источник