Отбор проб почв микробиологический анализ
Санитарно-бактериологическое исследование почвы — Н. А. Бельская
Почва является основным местом обитания многих микроорганизмов (см. главу 6). Из почвы микробы поступают в воду и обсеменяют воздух.
Микробиологическое исследование почвы имеет важное значение. Оно проводится при выборе участка для строительства детских учреждений, спортивных площадок, больниц, госпиталей, военных лагерей, водопроводных сооружений и других объектов.
Санитарно-микробиологический анализ почвы включает определение:
1) общего количества бактерий в 1 г почвы;
2) титра санитарно-показательных микроорганизмов БГКП и С. perfringens;
3) термофильных бактерий в 1 г почвы;
4) по эпидемиологическим показаниям проводится исследование на наличие патогенных микроорганизмов (сальмонелл, шигелл, клостридий столбняка, ботулизма, некоторых вирусов и др.).
Отбор проб почвы. Выбор места для отбора проб почвы определяется санитарным врачом и бактериологом в зависимости от цели и задачи исследования. На обследуемой территории до 1000 м 2 выделяют два участка площадью 25 м 2 . Один должен быть расположен близ источников загрязнения (свалки, мусорные ящики, выгребные ямы и т. д.), другой — в отдалении от них (контроль). На каждом участке в 25 м 2 намечают для отбора проб пять точек: четыре по углам и одна в центре или пять точек по диагонали участка.
Для исследования поверхностного слоя почвы пробы отбирают стерильной лопаткой или совком на глубине до 20 см. Из отдельных точек участка лопаткой выкапывают цельный кусок почвы. Стерильным ножом снимают верхний слой толщиной 1,5-2,0 см и из середины куска набирают стерильной ложкой 200-300 г почвы. Смешанный образец, составленный из пяти отдельно взятых проб почвы, должен весить не менее 1 кг.
При исследовании образцов из глубинных слоев почвы (от 0,75 до 2 м) пользуются специальным буром с полостью. На заданной глубине полость бура открывается, наполняется почвой, затем механически закрывается, и бур извлекают на поверхность.
Пробы почвы, взятые для анализа, переносят в стерильные банки с ватно-марлевыми пробками и покрывают стерильной пергаментной бумагой. К каждой банке приклеивают этикетку с указанием даты и номера пробы. В сопроводительном документе отмечают характер почвы, расположение источников загрязнения, площадь обследуемой территории, данные, характеризующие климат местности и т. п.
Все пробы помещают в деревянный ящик с гнездами и немедленно транспортируют в лабораторию. Если нет возможности приступить к исследованию почвы в тот же день, то допускается хранение проб в холодильнике при 1-2° С в течение суток.
Подготовка проб почвы к исследованию. Образцы почвы, отобранные на одном участке из нескольких точек, хорошо перемешивают, освобождают от крупных включений (щебня, камней, корней, стекол). От среднего образца отделяют 200-300 г и вносят в стерильную посуду. Затем почву дробят в стерильной ступке, просеивают через стерильное сито на стерильную бумагу и берут для исследования навеску в 30 г. Навеску почвы высыпают в стерильную колбу вместимостью 500 мл и доливают 270 мл стерильной водопроводной воды, получают разведение почвы 1:10. Взбалтывают почвенную взвесь 10-15 мин и из приготовленного разведения 1:10 без отстаивания готовят ряд последовательных десятикратных разведений по общепринятой методике. При анализе чистых почв ограничиваются 3-4 разведениями (до 1:1000, 1:10000), при исследовании загрязненных почв используют разведения — до 1:100000, 1:1000000.
Определение общего количества бактерий в почве проводят аналогично исследованию воды. Показатели общего количества бактерий для различных видов почв представлены в табл. 55.
Определение БГКП как показателя фекального загрязнения проводят двумя методами: титрационным и методом мембранных фильтров.
Из первоначального разведения почвенной взвеси 1:10 стерильной пипеткой берут 10 мл, что соответствует 1 г почвы, и засевают во флаконы с 50 мл среды Кесслер. Затем из каждого разведения почвы засевают по 1 мл в пробирки с поплавками, содержащими 9 мл той же среды. Посевы выращивают в термостате 24 ч при 37° С.
Просматривают посевы (при задержке роста посевы оставляют на третьи сутки). Отсутствие газообразования и помутнения в бродильных сосудах со средой Кесслер через 48 ч позволяет дать отрицательный ответ.
При наличии в средах газообразования и помутнения или только помутнения из этих сосудов производят высев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.
Просматривают посевы. Отсутствие роста на среде Эндо дает право на отрицательный ответ.
Если на среде Эндо вырастают типичные для кишечной палочки колонии, то из них делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба на оксидазу отрицательная, то проверяют ферментативные свойства выделенной культуры путем посева на полужидкую среду с глюкозой. Посевы помещают в термостат на 24 ч при 37° С.
Просматривают посевы. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие кишечной палочки в исследуемом разведении почвы.
Коли-титр почвы определяют по наименьшему объему, в котором обнаруживают БГКП (показатели коли-титра для различных видов почв представлены в табл. 55).
Таблица 55. Схема оценки санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям
Метод мембранных фильтров применяют при исследовании малозагрязненных почв. Через стерильные мембранные фильтры № 3 пропускают по 10 мл почвенной взвеси из разведений 1:10, 1:100, 1:1000. Дальнейший ход исследования аналогичен определению кишечных палочек в воде. Метод мембранных фильтров позволяет сократить срок исследования до двух суток. Результаты анализа выражают коли-индексом. Коли-индекс почвы — это количество кишечных палочек в 1 г почвы.
Примечание. Среда Кесслер содержит лактозу, которую сбраживают БГКП, и генциановый фиолетовый, задерживающий рост грамположительной микрофлоры.
Из всех приготовленных почвенных разведений (от 1:10 до 1:1000000) по 1 мл вносят в два параллельных ряда стерильных пробирок. Один ряд пробирок прогревают при 80° С 15 мин для освобождения от неспороносной микрофлоры. Затем во все пробирки наливают по 9 мл расплавленной и остуженной до 45° С среды Вильсона — Блера, приготовленной ex tempore. Пробирки вращают между ладонями, чтобы посевной материал равномерно распределился в питательной среде, и быстро опускают их в холодную воду для удаления кислорода и охлаждения среды. Посевы выращивают при 43° С 24 ч.
C. perfringens дает рост в глубине среды в виде черных колоний. Газообразование регистрируется по разрыву питательной среды. В мазках, приготовленных из колоний, обнаруживают грамположительные крупные палочки со спорами овальной формы, расположенные центрально или субтерминально.
Предельное разведение почвенной взвеси, которое дает на среде Вильсона — Блера рост C. perfringens, означает титр этого микроба в почве (см. табл. 55). Наличие в почве C. perfringens является косвенным показателем присутствия в ней и других клостридий — возбудителя столбняка (C. tetani), возбудителя ботулизма (C. botulinum).
В почве определяют также количество термофильных бактерий в 1 г. Почва, в которой много кишечных палочек и мало термофилов, может рассматриваться как загрязненная фекалиями.
Среда Кесслер. К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят 20-30 мин, фильтруют через вату, прибавляют 10 г лактозы и доводят объем до 1 л. Устанавливают рН 7,4-7,6. Добавляют 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового. Среду разливают в колбы и пробирки с поплавками. Стерилизуют 15 мин при давлении 0,5 атм (112° С). Среда имеет фиолетовый цвет.
Контрольные вопросы
1. В каких случаях проводят санитарно-бактериологическое исследование почвы?
2. Какие определения включают санитарно-бактериологический анализ почвы?
3. Как проводят отбор проб почвы?
4. Какими методами определяют наличие БГКП в почве?
Задания
1. Приготовьте из почвенной взвеси в разведении 1:10 ряд последовательных разведений 1:100, 1:1000,1:10000 и проведите определение микробного числа в данной пробе почвы.
2. Возьмите у преподавателя готовые посевы разведений почвы на среде Вильсона — Блера, определите титр C. perfringens. Сделайте мазки из колоний, окрасьте по Граму. Найдите под микроскопом в мазках C. perfringens и покажите преподавателю. Результаты микроскопии зарисуйте в тетрадь.
Источник
Отбор проб почв микробиологический анализ
При выборе места для отбора проб почвы с целью санитарно-микробиологического анализа необходимо знать особенности топографии местности, почвенного и растительного покрова (тип, механический состав, рельеф и т. п.), климата, размеры исследуемой территории, наличествует или отсутствует на участке канализация, расстояние от источников загрязнения воды и почвы, характер землепользования.
Если нет особых указаний, на обследуемой территории до 1000 м 2 выделяют два участка по 25 м 2 . Один должен быть расположен вблизи источников загрязнения (свалки, выгребные ямы, мусорные ящики и пр.), а другой—в отдалении от них (контроль). Если па исследуемом участке имеется несколько источников загрязнения, то выделяют участки около каждого из них. При отсутствии видимых источников загрязнения выделяют участки на каждом элементе рельефа изучаемой земельной площади.
Если обследуются значительные территории, то на каждые 100 га при спокойном рельефе местности намечают для отбора проб почвы 6-7 участков площадью по 25 м 2 .
На каждом участке намечают пять точек по диагонали или четыре — по углам и одну в центре участка. В соответствии с этим отбирают 10 проб (из разных мест исследуемой территории). Почву берут стерильным ножом, лопатой или совком на глубине до 20 см (иногда из более мелких слоев — до 10 см или более глубоких). Образец массой 200-300 г помещают в стерильную банку или чистый прочный полиэтиленовый пакет и хорошо перемешивают. Следовательно, смешанный образец с каждого из двух выбранных участков должен иметь массу не менее 1 кг. Банки или пакеты закрывают и снабжают этикетками со сведениями об отобранных в них пробах.
Образцы из глубоких слоев почвы (0,75-2,0 м) берут буром (почвенный бур Некрасова и др.). При отсутствии бура делают разрез до нужной глубины и стерильной лопаткой или ножом отбирают несколько образцов почвы с отвесной стороны ямы соответственно каждому горизонту. Пробы отбирают осторожно от нижнего горизонта к верхнему, чтобы не смешать их с вышележащими слоями почвы.
При отсутствии достаточного количества стерильных инструментов для отбора проб необходимо перед взятием каждого нового образца почвы инструмент обмыть, обтереть спиртом и затем обжечь.
Отобранные пробы анализируют в тот же день. Допускается хранение образцов почвы в лаборатории не более 24 ч в холодильнике при температуре 1-5 °С. Более продолжительное хранение обесценивает результаты анализа.
Подготовка почвы для анализа. Образцы почвы освобождают от крупных включений (корни, щебень, стекло и т. п.), крупные почвенные агрегаты дробят. Почву доводят до воздушно-сухого состояния, тщательно перемешивают и высыпают на стерильную бумагу. Затем готовят средний образец почвы одного участка массой 0,5 кг. Отобранную почву тщательно размельчают и просеивают через стерильное сито (размер ячеек 3 мм), высыпают на стерильную бумагу, хорошо перемешивают. Готовят навеску (30 г) и вносят ее в стерильную чашку с гладкой поверхностью.
Почву растирают с 10-15 мл стерильной воды, которую отливают из колбы, содержащей 270 мл стерильной водопроводной воды. После растирания в течение 5 мин почву переносят в упомянутую колбу с водой. Почву, оставшуюся на чашке, смывают в колбу водой, которую берут из нее же. Затем колбу с почвой тщательно встряхивают в течение 10 мин (или обрабатывают 3 мин на мешалке механического диспергатора—размельчитель тканей РТ-2 идр.). Из полученной суспензии без отстаивания готовят разведения. Из первоначальной взвеси (1:10) отбирают стерильной пипеткой 1 мл и вносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды, тщательно перемешивают.
Из полученного разведения почвы (в 100 раз) готовят таким же образом последующие разведения (10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 ). Причем для приготовления каждого нового разведения необходимо использовать свежую стерильную пипетку. Таким образом, 1 мл взвеси 1:10 соответствует 0,1 г почвы, 1 мл разведения 1:100-0,01 г и т. д.
В ряде лабораторий для приготовления исходной суспензии (1:10) используют навески от 1 до 10 г и соответствующее количество стерильной воды. Полученная взвесь встряхивается в течение 10 мин (или 3 мин на мешалке) и немедленно используется для приготовления разведений, как описано выше.
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 29.09.2019
Источник
Отбор проб почв микробиологический анализ
Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа
Nature protection. Soils. Methods for sampling and preparation of soil for chemical, bacteriological, helmintological analysis
Дата введения 2019-01-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Ассоциацией «Некоммерческое партнерство Координационно-информационный центр государств — участников СНГ по сближению регуляторных практик» (Ассоциация «НП КИЦ СНГ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 ноября 2017 г. N 52)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
ЗАО «Национальный орган по стандартизации и метрологии» Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
Институт стандартизации Молдовы
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 апреля 2018 г. N 202-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 17.4.4.02-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
ВНЕСЕНЫ: поправка, опубликованная в ИУС N 1, 2021 год; поправка, опубликованная в ИУС N 10, 2021 год
Поправки внесены изготовителем базы данных
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на случаи общего и локального загрязнения почв, происшедшего в результате аварийных розливов и просыпки токсичных материалов, аварийных залповых выбросов вредных и токсичных веществ, разрывов канализационных коллекторов, разрушения дамб и обваловок шламонакопителей и в других аварийных ситуациях для установления факта наличия загрязнения.
Настоящий стандарт устанавливает методы отбора и подготовки проб почвы естественного и нарушенного сложения для химического, бактериологического и гельминтологического анализа.
Настоящий стандарт предназначен для контроля общего и локального загрязнения почв в районах воздействия промышленных, сельскохозяйственных, хозяйственно-бытовых и транспортных источников загрязнения, при оценке качественного состояния почв, а также при контроле состояния плодородного слоя, предназначенного для землевания малопродуктивных угодий и при осуществлении государственного экологического надзора.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 17.4.2.01-81 Охрана природы. Почвы. Номенклатура показателей санитарного состояния
ГОСТ 17.4.2.02-83 Охрана природы. Почвы. Номенклатура показателей пригодности нарушенного плодородного слоя почв для землевания
ГОСТ 17.4.3.01-83 Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 892-89 Калька бумажная. Технические условия
ГОСТ 1341-97 Пергамент растительный. Технические условия
ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3251-91 Клеенка подкладная резинотканевая. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5180-2015 Грунты. Методы лабораторного определения физических характеристик
ГОСТ 6613-86 Сетки проволочные тканые с квадратными ячейками. Технические условия
ГОСТ 8273-75 Бумага оберточная. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 12302-2013 Пакеты из полимерных пленок и комбинированных материалов. Общие технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 18300-87* Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 55878-2013 «Спирт этиловый технический гидролизный ректификованный. Технические условия».
ГОСТ 19126-2007 Инструменты медицинские металлические. Общие технические условия
ГОСТ 19596-87 Лопаты. Технические условия
ГОСТ 23707-95 Инструмент мелкий для обработки почвы. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 30090-93 Мешки и мешочные ткани. Общие технические условия
ГОСТ 33781-2016 Упаковка потребительская из картона, бумаги и комбинированных материалов. Общие технические условия
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Аппаратура, материалы, реактивы
Ножи почвенные по ГОСТ 23707.
Ножи из полиэтилена или полистирола по технической документации.
Буры почвенные по технической документации.
Холодильник, поддерживающий температуру от 4°C до 6°C по ГОСТ 16317.
Холодильники-сумки по технической документации.
Весы лабораторные общего назначения с предельной нагрузкой 200 и 1000 г по ГОСТ OIML R 76-1.
Кюветы эмалированные по технической документации.
Кристаллизаторы стеклянные по ГОСТ 25336.
Сита почвенные с сеткой 0,25; 0,5; 1; 3 мм по ГОСТ 6613.
Спиртовки лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336.
Ступки и пестики фарфоровые по ГОСТ 9147.
Ступки и пестики яшмовые, агатовые или из плавленого корунда по технической документации.
Флаконы или банки стеклянные широкогорлые с притертыми пробками вместимостью 300, 500, 800, 1000 см по технической документации.
Банки или коробки из пищевого полиэтилена или полистирола по технической документации.
Шпатели металлические по ГОСТ 19126.
Шпатели пластмассовые по ГОСТ 19126.
Совки по технической документации.
Бумага оберточная по ГОСТ 8273.
Клеенка медицинская по ГОСТ 3251.
Мешочки тканевые по ГОСТ 30090.
Пакеты и пленка полиэтиленовые по ГОСТ 12302.
Источник