Питательные среды для выращивания аэробных микроорганизмов

2. Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов

Поскольку микроорганизмы по-разному относятся к молекулярному кислороду, это определяет и различия в способах их культивирования.

Культивирование аэробных микроорганизмов проводят следующим образом:

• на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха;

• в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование.

Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для создания анаэробных условий используют различные приемы. Их подразделяют на физические, химические и биологические. Все они основаны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом пространстве.

К физическим методам создания анаэробных условий относится культивирование в микроанаэростате – вакуумном аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с 5 % СО₂ и 10 % Н₂.

К химическим методам относится:

1) Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na₂S₂O₄), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы.

2) Использование восстанавливающих агентов, которые добавляют в большинство сред для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, аскорбиновая кислота.

Как пример биологического способа создания анаэробных условий — выращивание совместно с аэробными или факультативно-анаэробными бактериями. Например, питательную среду в чашке Петри разделяют желобком на две половины, на одну половину засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой – анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется только после полного использования кислорода аэробом.

Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре:

• выращивание в высоком слое среды;

• выращивание в толще плотной среды;

• культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекулярного кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее плотности;

• заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового масла или парафина.

3. Методы количественного учета микроорганизмов.

О росте микроорганизмов в естественных субстратах или питательных средах судят по величине титра клеток.

Титр клеток (или фаговых частиц) – это количество клеток в единице объема.

Выбор метода для определения числа клеток зависит от:

1) цели исследования;

2) свойств питательной среды или субстрата;

3) особенностей роста и морфологии микроорганизмов.

Существуют методы, позволяющие определять: 1) общее количество микроорганизмов в исследуемом материале; 2) только количество жизнеспособных клеток.

С другой стороны, методы количественного учета микроорганизмов могут быть разделены на прямые и косвенные:

1) прямые методы – это методы прямого счета (микроскопические);

2) косвенные – а) основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (методы оптические (нефелометрия, спектрофотометрия и т. д.); б) методы подсчета колоний (методы высева).

Методы прямого подсчета клеток под микроскопом используют для определения общего количества микроорганизмов в различных материалах. Это такие методы как подсчет в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, на мембранных фильтрах.

Преимущества использования методов прямого подсчета клеток:

— широко применяются в исследованиях микрофлоры воды и почвы;

— эффективность такого подсчета, как правило, в 10 – 10000 раз выше, чем при подсчете методом высева, так как многие микроорганизмы не растут на питательных средах и учесть их можно только под микроскопом;

— позволяет определить общее количество клеток в единице объема (как живых, так и мертвых, либо эти группы клеток по отдельности);

— дает возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта;

— производится быстрее, более дешев, оборудование для его осуществления имеется в каждой лаборатории.

Основное ограничение большинства методов данной группы – необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.

Определение количества микробных клеток нефелометрическим методом. Этот метод широко применяется в микробиологических исследованиях, так как позволяет достаточно точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В основе метода лежит измерение количества света, рассеянного взвесью клеток. Величину светорассеяния измеряют с помощью нефелометров, спектрофотометров или фотоэлектроколориметров. В этих приборах измеряется первичный пучок света, который проходит через пробу и, не отклоняясь, падает на фотоэлемент. Обычно при этом сравнивается интенсивность света, проходящего через суспензию клеток и через среду без клеток. Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечивающий максимум пропускания света данной взвесью. Питательная среда для культивирования микроорганизмов, в которой предполагается определять количество клеток по рассеиванию, должна быть оптически прозрачной.

Определение количества жизнеспособных клеток путем высева на питательные среды (чашечный метод Коха). Сущность метода подсчета количества клеток путем высева заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на агаризованную питательную среду в чашках Петри и подсчете формирующихся колоний, принимая во внимание, что каждая колония – потомство одной жизнеспособной клетки. Существует много вариантов метода:

При посеве на поверхность агара (метод Коха). Проводят в три этапа: приготовление разведений исследуемого материала, посев на агаризованную среду в чашках Петри и подсчет сформировавшихся колоний.

Метод посева в агаризованную среду осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии микроорганизмов из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной до 45 0 агаризованной средой. Содержимое чашки перемешивают и дают среде застыть.

Метод посева в тонком слое агаризованной среды предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 –3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою.

Каждый из вышеперечисленных методов посева имеет свою область использования и определенные ограничения. При посеве на поверхность агаризованной среды все выросшие колонии являются поверхностными. Именно в этом случае изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. При посеве в агаризованные среды колонии, как правило, компактны и невелики по размерам, так как формируются под слоем агара, что дает возможность учета большего их количества. Вторым преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом среды: верхний и нижний слой могут содержать разные питательные добавки. Кроме того, к верхнему слою могут быть добавлены красители для облегчения обнаружения колоний.

Источник

Особенности культивирования и выделения аэробных и анаэробных бактерий

Под понятием культивирование бактерий, которое использует микробиология, подразумевается процесс выделения отдельных типов, видов либо клонов микроорганизмов. Благодаря естественным и искусственным субстратам можно получать комбинации из различных микроорганизмов.

Когда возникает потребность в чистых культурах?

Под чистыми культурами подразумевается набор бактерий, которые относятся к одному виду и обладают сходными культуральными, химическими и морфологическими характеристиками.

Применяться такие культуры могут в следующих случаях:

1. При необходимости изучить систематику и переменчивость отдельных бактерий.
2. При необходимости диагностировать инфекционное заболевание.
3. В промышленных целях – в виде сырья для создания антибиотиков, витаминных и ферментных препаратов, гормонов стероидного типа, вакцин и прочих продуктов.
4. В пищевой промышленности – в виде сырья для производства пива, вина, создания хлебобулочной и молочной продукции.

Чтобы получить чистые культуры отдельных микроорганизмов, применяются следующие методы: капельная технология Линднера, метод Ганзена с использованием влажной камеры, метод выделения из единой колонии на желатиновой либо агарной среде и микроманипуляторный метод.

Какие среды могут использоваться для культивирования аэробов?

Аэробы представляют собой микроорганизмы, для размножения и жизнедеятельности которых требуется кислород в свободном виде.

Современная микробиология предполагает принципы выделения аэробов на сложных и простых, полужидких, жидких, а также твердых питательных средах.

Среди самых распространенных простых питательных сред – мясопептонный агар, молоко, пептонная вода, картофельные ломтики, мясопептонный бульон.

Сложные среды представлены в виде простых составов, разбавленных специальными добавками – животной сывороткой, кровью, асцитической жидкостью и т.п.

Среды, в зависимости от целей дальнейшего использования микроорганизмов, подразделяют на следующие виды:

1. Элективные. К таким средам относятся те, на которых рост аэробных и анаэробных микроорганизмов происходит значительно интенсивнее.
2. Среды накопления (обогащения) дают возможность накопить либо же изолировать определенную разновидность бактерий. К данной группе относятся такие питательные среды, как среды Мюллера, Кауфмана и Килиана, благодаря которым удается изолировать распространение дифтерийных, паратифозных, тифозных и кишечных микроорганизмов.
3. Дифференциально-диагностические среды. Их применяют при необходимости дифференцирования разновидности исследуемого микроорганизма, а также определения его качественных характеристик.
4. Консервирующие среды, состоящие из веществ (к примеру, глицерина), благодаря которым имеется возможность в процессе транспортировки сохранять в живом виде патогенные микроорганизмы.

Какими методами выполняют культивирование?

В микробиологии выведение бактерий аэробного типа может происходить в следующих условиях:

1. Условия, для которых берутся плотные питательные среды либо прослойка жидкой среды, в которой получение кислорода происходит из окружающего воздуха.
2. Условия, при которых размножение происходит в питательных жидких средах (глубинный метод культивирования). Получение кислорода микроорганизмами в данном случае происходит из растворенных растворенных в жидкости молекул. Чтобы при низком содержании кислорода бактерии аэробного типа росли более интенсивно, жидкость потребуется аэрировать.

Используя такие методы, можно получить чистые аэробные культуры, используемые для разнообразных целей не только в медицине, но и промышленной и пищевой индустрии.

Культивирование микроорганизмов-анаэробов: основные особенности

Анаэробы представляют собой микроорганизмы, развитие и деление которых происходит в среде, не содержащей кислород в свободном виде. Обнаруживаются они практически во всех человеческих тканях, пробы берутся из воспалительно-гнойных очагов.

Принципы выращивания анаэробных микроорганизмов представляют собой более длительную и хлопотную процедуру, чем культивирование аэробных форм. Связано это с тем, что контакт культур с кислородом нужно свести к минимуму. Чтобы анаэробные условия были правильными, применяются разные методы, которые условно разделяются на биологические, химические и физические. Несмотря на свои особенности, все они имеют один сходный принцип – обеспечение замкнутого пространства.

Под физическими методами культивирования подразумевается выращивание микроорганизмов посредством микроанаэростата. В данном вакуумном агрегате вместо воздуха применяется газовая смесь.

К химическим методикам культивирования можно отнести:

1. Методы, при которых используются химические вещества, способные поглощать кислородные молекулы. Для реализации в лабораторных условиях берутся хлорид меди одновалентной, раствор пирогаллола щелочной, дитионит натрия, а также другие реактивы.
2. Метод, для которого используются восстанавливающие агенты, добавляемые с целью уменьшения окислительно-восстанавливающего эффекта среды. Происходить это может благодаря аскорбиновой кислоте, цистеину, тиогликолату натрия.

Что касается биологических способов размножения бактерий, то для их выполнения применяется, к примеру, чашка Петри, разделенная на две половины посредством желобка. В одной из половин помещаются анаэробные, а в другой – аэробные микроорганизмы, после чего края чаши заливаются парафином. Как только аэробы используют весь кислород, активируется рост анаэробных организмов.

Для культивирования молочнокислых бактерий могут применяться и другие способы:

1. Посев в высокие слоя питательных сред.
2. Размножение в плотных средах (с самой их толще).
3. Метод размножения в вязких условиях, при которых процесс диффузии кислородных молекул в жидкость снижается при повышении ее плотности.
4. Культивирование при помощи вазелинового масла либо стерильного парафина, заливаемого в питательную среду.

При наличии необходимых навыков, оборудования и реактивов, выделение анаэробных и других бактерий можно проводить и в домашних условиях.

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.

Источник