Питательные среды для выращивания антибиотиков

ГК «Униконс»

Продвижение и реализация комплексных пищевых добавок, антисептиков и др. продукции.

«Антисептики Септоцил»

Септоцил. Бытовая химия, антисептики.

«Петритест»

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

«АльтерСтарт»

Закваски, стартовые культуры. Изготовление любых заквасок для любых целей.

• Вы здесь:
• Библиотека технолога
• Пиво и напитки
• Г.С. Качмазов — Дрожжи бродильных производств

17. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ

К ним относят метод диффузии в агар и метод серийных разведений (на жидкой и плотной питатель­ных средах).

Для посева используют суточные чистые культуры выделенных микроорганизмов. При отсутствии возмож­ности получения чистой культуры можно использовать дрожжевую взвесь или производственный субстрат, содер­жащие всю микрофлору в исследуемом материале.

При исследовании материала, содержащего дрожже­вые клетки, в остывшие до
45–50°С питательные среды вносят нистатин и тщательно перемешивают.

17.1. МЕТОД ДИФФУЗИИ В АГАР (МЕТОД БУМАЖНЫХ ДИСКОВ)

Наиболее простой в исполнении метод, однако его нельзя считать количественным.

В качестве основы питательной среды целесообразно применять производственное агаризованное (2,5%) сусло с содержанием 120–140 мг% аминного азота. Питатель­ную среду разливают в чашки Петри слоем 4–5 мм. Перед посевом чашки со средой досушивают в термостате или в стерильном боксе.

Диски с антибиотиками (диаметр 5–6 мм) готовят из специальных сортов фильтровальной бумаги. Каждый диск содержит определенное количество антибиотика, которое указано на этикетке флакона. Во флакон насыпа­ют силикагель, который впитывает влагу и служит индикатором: при переувлажнении силикагель меняет окра­ску с синей на розовую. При изменении окраски силикагеля во флаконе диски для исполь­зования не пригодны. Флаконы с дисками хранят при температуре 4–20°С.

0,5 см 3 исследуемого материала наносят на агар и шпа­телем Дригальского тщательно распределяют по поверх­ности питательной среды до полного впитывания. Затем на поверх­ность среды стерильным пинцетом накладыва­ют, плотно прижимая, диски с разными антибиотиками на расстоянии 2–2,5 см друг от друга и от края чашки. Чашки с дисками выдерживают в термостате при 37°С в течение 24–48 ч в положении вверх дном.

Антибиотик из диска диффундирует в агар, вызывая гибель чувствительных бактерий, формируя таким обра­зом вокруг диска зону отсутствия роста. Ближе к диску концен­трация антибиотика в агаре выше, по мере удале­ния от диска концентрация снижается. Следовательно, чем больше диаметр зоны задержки роста вокруг антибиотика, тем более чувствительна к нему исследуемая культура.

Диаметр зоны задержки (отсутствия) роста микроорга­низмов измеряют с помощью линейки или миллиметровой бумаги с точностью до 1 мм. Отсутствие зоны задержки рос­та микроорганизмов вокруг диска указывает на устойчи­вость исследуемой культуры к данному антибиотику.

При зоне отсутствия роста до 10 мм культура счита­ется устойчивой, от 10 до 15 мм говорят о малой чувстви­тельности к антибиотику, от 15 до 25 мм – о достаточ­ной чувствительности, свыше 25 мм – о высокой чувст­вительности.

17.2. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ

Для проведения опыта готовят основные рас­творы антибиотиков. Готовятся они с та­ким расчетом, что­бы в первой пробирке концентрация антибиотика соста­вила 100 ЕД/см 3 .

На этикетке ампулы или флакона указана концентра­ция антибиотика в ЕД/см 3 или мкг/см 3 . Навески бензил-пенициллина калиевой или натриевой соли, ампициллина три­гид­рата, оксациллина натриевой соли, цефалотина, цефалексина растворяют в 1/15 М фосфатном буфере (ка­лия фосфат однозамещенный – 3,63 г, натрия фосфат двузаме­щенный – 7,13 г, вода дистиллированная – до 1000 см3). Основные растворы тетрацик­линовых антибио­тиков готовят на 0,01 Н растворе соляной кислоты. Для приготовления основных растворов нео-, моно—, канамицина используют дистиллированную воду.

Если на этикетке препарата дозировка указана в весо­вых единицах, следует иметь в виду, что для большей час­ти антибиотиков 1 г активного вещества соответствует 1 000 000 ЕД. Из этого расчета и следует разводить анти­биотик.

Если порошок антибиотика, расфасован немерно и на этикетке указано количество единиц активности в 1 мг, необходимо к точной навеске препарата, сделанной на аналитических весах, добавить равный объем раствори­теля, т. е. получить раствор мг/см 3 , в 1 см 3 которого со­держится столько единиц, сколько их было указано на этикетке. Из этого основного раствора делают дальней­шие разведения.

Для определения чувствительности микробов к суль­фаниламидам может быть применен любой из указанных методов, причем во внимание принимается только степень разведения навески препарата.

17.2.1. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ В ЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

На основе стерильного производственного сусла гото­вится серия 2-кратных серийных разведений исследуемо­го антибиотика. Первая пробирка содержит 100 ЕД/см 3 антибиотика, каждая последующая – в два раза мень­ше. Засевная доза исследуемой суточной бактериальной культуры составляет 10% от общего объема питательной среды.

Питательную среду разливают по 4,5 см 3 в пробирки, расставленные в штативы по 10 в каждом ряду. Готовят основной раствор антибиотика и добавляют 4,5 см 3 этого раствора в первую пробирку. После тщательного перемешивания новой стерильной мерной пипеткой переносят 4,5 см 3 из этой пробирки в следующую и т. д. до девятой пробирки, из которой 4,5 см 3 выливают. Десятая пробир­ка, не содержащая антибиотика, служит контролем роста культуры.

Для постановки этого опыта используют имеющиеся в продаже препараты, на этикетке которых указано количе­ство единиц во флаконе. Например, если флакон содержит 500 000 ЕД пенициллина, то, добавив в него 10 см 3 дистил­лированной воды, получают раствор, содержащий в 1 см 3 50 000 ЕД, при дальнейшем разведении в 100 раз получа­ют раствор с концентрацией пенициллина 500 ЕД/см 3 . Для получения требуемой концентра­ции антибиотика даль­нейшие разведения целесообразнее делать с использова­нием стерильной питательной среды.

Чистые агаровые или бульонные культуры микроор­ганизмов предварительно разводят физиологическим рас­твором до концентрации клеток 5·10 6 клеток/см 3 в соот­ветствии со стандартом мутности.

Агаровую культуру испытуемого микроба смывают изотоническим раствором хлорида натрия. Полученную взвесь по 1,0 см 3 вносят во все пробирки ряда, начиная с контроль­ной.

Результаты регистрируют после инкубации при 37°С в течение 24–48 ч. Последняя пробирка с прозрачным бульоном, при наличии густого роста в контроле, опреде­ляет минимальную, подавляющую рост данного микро­организма концентрацию антибиотика.

Учет результатов: наименьшее количество антибиоти­ка, дающее визуально полную задержку роста (среда про­зрачная), соответствует минимальной подавляющей кон­центрации препарата (МПК или МБсК). Минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) определяют вы­севом на плотные питательные среды из последних про­зрачных пробирок, которые предварительно встряхива­ют. Наименьшее количество антибиотика в пробирке, со­держимое которой после инкубирования в течение 24–72 ч не дало роста бактерий при высеве на питательную среду, принимают за МБцК.

17.2.2. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ НА ПЛОТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

Для определения чувствительности к антибиотикам большинства микроорганизмов используют МПА или 2,5%-ный агар на основе производственного сусла с со­держанием аминного азота 120–140 мг/см 3 . Приготовлен­ный основной раствор антибиотиков разво­дят в плотной питательной среде. Для этого к расплавленному и охлаж­денному до 55°С агару, разлитому в широкие пробирки по 18 см 3 , добавляют по 2 см 3 соответствующего разведения определенного антибиотика, тщательно перемешивают и переливают в сте­рильную чашку Петри. После застывания агара чашки Петри подсушивают в течение 1 ч. Контроль­ные чашки Петри с агаром не содержат антибиотика. Все чашки Петри делят на сектора, каждый из которых засева­ют исследуемой культурой. Посев делают бакте­риологиче­ской петлей из микробной суспензии с концентрацией кле­ток 10 6 –10 7 клеток/см 3 . Чашки помещают в термостат при 37°С на 24–48 ч.

Наименьшую концентрацию антибиотика, при кото­рой наблюдают полную задержку роста бактерий на агаре или рост единичных колоний, принимают за МПК препа­рата. В том случае, когда рост культуры отсутствует на всех чашках, кроме контрольной, считают, что исследуе­мые концентрации антибиотиков превышают МПК пре­парата. Если на всех чашках отмечают рост культуры, это значит, что микроорганизм устойчив ко всем концентра­циям антибиотика.

Общую чувствительность к сульфаниламидам, как и к антибиотикам, можно определить методом канавки. На агаре в чашке Петри по ее диаметру прорезают канавку, в которую вносят определенное разведение изучаемого пре­парата. Перпендикулярно к канавке засевают штрихом изучаемые культуры микроорганизмов. После инкубации при 37°С 24–48 ч отмечают наличие участков задержки роста микроорганизмов, если послед­ние чувствительны к данному препарату.

Источник

Питательные среды для выращивания антибиотиков

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ
К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ: Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии (Н.А.Семина, С.В.Сидоренко); Государственным научным центром по антибиотикам (С.П.Резван, С.А.Грудинина); Научно-исследовательским институтом антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии (Л.С.Страчунский, О.У.Стецюк, Р.С.Козлов, М.В.Эйдельштейн); Кафедрой микробиологии и химиотерапии Российской медицинской академии последипломного образования (Е.А.Ведьмина, Л.Г.Столярова, И.В.Власова); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (З.С.Середа).

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 4 марта 2004 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН «Методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков», утв. Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР В.Е.Ковшило 10 марта 1983 г. N 2675-83.

1. Область применения

1.1. В настоящих методических указаниях изложены стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (методы серийных разведений и диско-диффузионный метод).

1.2. Методические указания предназначены для применения в микробиологических лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы и здравоохранения.

2. Общие сведения

Определение чувствительности микроорганизмов — возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам (АБП) — приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотико-резистентности у бактерий. Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП (диско-диффузионный и серийных разведений) были разработаны во второй половине 60-х — начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений.

Однако внедрение в клиническую практику значительного количества новых АБП и появление новых механизмов антибиотико-резистентности у микроорганизмов потребовало более строгой стандартизации процедуры тестирования, разработки новых подходов к интерпретации результатов, внедрения современной системы внутреннего контроля качества на каждом этапе исследования.

В настоящих методических указаниях систематизированы современные подходы к определению чувствительности бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний человека, учитывающие рекомендации Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам, а также Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США.

Исследования чувствительности микроорганизмов к АБП осуществляются для решения следующих задач:

— обоснование целенаправленной индивидуальной антибактериальной терапии для лечения конкретной инфекционной болезни отдельным пациентам;

— обоснование эмпирической терапии отдельных нозологических форм инфекционных болезней в пределах лечебных учреждений или географических регионов;

— осуществление наблюдения за распространением антибиотико-резистентности в отдельных учреждениях или географических регионах;

— исследование новых химических соединений на наличие антибактериальной активности.

3. Показания для исследования чувствительности микроорганизмов
к антибактериальным препаратам

В ходе повседневной деятельности в бактериологических лабораториях из различных биологических материалов и объектов внешней среды выделяют множество бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Однако определение чувствительности выделенных микроорганизмов к АБП показано далеко не во всех случаях. Определение показаний для исследования чувствительности микроорганизмов к АБП является обязанностью врача-бактериолога.

Определять чувствительность к АБП представителей нормальной микрофлоры человека, при их выделении из естественных мест обитания, бактерий, выделенных из объектов внешней среды, за исключением случаев проведения специальных исследований, нецелесообразно.

Обязательному исследованию на чувствительность к АБП подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека. В остальных случаях оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма.

Определение чувствительности выделенного штамма микроорганизма показано, если уровень его устойчивости к АБП не может быть предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма. Практически важной задачей является выявление приобретенной резистентности к АБП у природно-чувствительных к ним микроорганизмов. Подтверждение природной чувствительности или резистентности микроорганизма к АБП не является целью практических исследований.

Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева образца клинического материала, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры.

При обнаружении на плотных питательных средах после первичного посева смешанной культуры исследовать антибиотикочувствительность до идентификации и оценки этиологической значимости отдельных микроорганизмов нецелесообразно.

Прямое определение чувствительности с использованием клинического материала (без выделения чистой культуры) возможно только в исключительных случаях при условии подтверждения однородности культуры и высокой степени обсемененности при окраске по Граму, причем исследование следует повторить после выделения чистой культуры микроорганизма.

Следует уделять особое внимание определению чувствительности микроорганизмов, относящихся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной резистентности.

У микроорганизмов, проявляющих универсальную чувствительность к каким-либо АБП, т.е. когда случаев резистентности не описано (например, Streptococcus pyogenes — все штаммы чувствительны к пенициллину), проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно.

Факты выявления резистентности у микроорганизмов, для которых этот феномен ранее не был описан в научной литературе, следует оценивать с крайней осторожностью и рекомендуется обращаться за консультациями в лаборатории, занимающиеся изучением антибиотико-резистентности.

Не следует в практических целях исследовать микроорганизмы, для которых методы определения чувствительности в настоящее время не стандартизованы и отсутствуют критерии интерпретации результатов. Результаты, полученные в данном случае, не могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма не приведена в утвержденной инструкции по его применению.

4. Методы определения чувствительности микроорганизмов
к антибактериальным препаратам

4.1. Общая характеристика методов

Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП подразделяют на методы серийных разведений и диффузионные.

Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП — величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК).

МПК — минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде.

Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений.

Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пограничным значениям МПК (см. ниже). Этот принцип исследования широко используется в автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов.

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК.

В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест.

В диско-диффузионном методе в качестве носителя АБП используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. Однако диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или резистентный).

Е-тест представляет собой узкую полоску полимера (0,5х6,0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации АБП в каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю. Детальные инструкции по определению чувствительности с использованием Е-тестов прилагаются изготовителем к набору реактивов.

4.1.1. Основные этапы проведения тестирования

Оценка антибиотикочувствительности, независимо от конкретного метода, предполагает последовательное выполнение нескольких этапов:

— приготовление питательных сред;

— приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма);

— учет и интерпретация результатов, формулировка рекомендаций по лечению.

Диффузионные методы включают также этап наложения дисков или полосок Е-теста на плотную питательную среду.

4.1.2. Приготовление питательных сред для определения чувствительности

Для оценки чувствительности используют специально предназначенные для этой цели среды, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке и по своим характеристикам удовлетворяющие требованиям, приведенным в разделе 5. Внутрилабораторный контроль качества среды проводят при использовании всех сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

Вид питательной среды для оценки чувствительности определяют выбранным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тестируемого микроорганизма.

Выбранную питательную среду для определения чувствительности готовят из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду сразу же разливают в стерильные пробирки или в чашки Петри, или (если необходимо) колбы со средой помещают на водяную баню при 48-50 °С, где выдерживают до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят термолабильные питательные добавки и/или рабочие растворы антибиотиков, а затем разливают в пробирки или в чашки Петри.

Агар разливают по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм — 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4-8 °С в течение 5 суток.

4.1.3. Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма)

Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, ее концентрация должна составлять 1,5·10 КОЕ/мл. Практически наиболее приемлемым методом оценки концентрации бактериальной суспензии является измерение ее оптической плотности. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией 1,5·10 КОЕ/мл при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0,5 по МакФарланду. Контроль оптической плотности суспензии можно также осуществлять спектрофотометрически (денситометрически). Существуют коммерчески доступные стандарты мутности и спектрофотометры. Бактериальную суспензию можно готовить либо из бульонной, либо из агаровой культуры.

Приготовление инокулюма из агаровой культуры

Для приготовления инокулюма используют чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту МакФарланда. Инокулюм следует использовать в течение 15 мин после приготовления.

Приготовление инокулюма из бульонной культуры

При определении чувствительности быстро растущих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления инокулюма также можно использовать 5-6-часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0-5,0 мл жидкой неселективной питательной средой. Инкубируют при 35 °С. Через 5-6 ч инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.

Стандарт МакФарланда может быть либо приобретен, либо приготовлен в лаборатории.

4.1.4. Приготовление стандарта 0,5 по МакФарланду

К 0,5 мл раствора ВаСl в концентрации 0,048 моль/л (1,175% раствор ВаСl ·2H O) медленно при тщательном перемешивании добавить 99,5 мл раствора H SO в концентрации 0,18 моль/л (1%) до получения гомогенной суспензии.

Правильность приготовления суспензии необходимо проверить на спектрофотометре. Поглощение при использовании кюветы 1 см должно составить 0,08-0,10 при длине волны 625 нм.

Полученную суспензию необходимо разлить по 4-6 мл в пробирки с герметично закрывающимися крышками. Пробирки должны быть такого же диаметра, как и используемые для приготовления бактериальной суспензии.

Хранить пробирки с суспензией необходимо в темноте при комнатной температуре.

Перед использованием пробирки необходимо тщательно встряхивать и оценивать однородность суспензии. При появлении видимых частиц пробирки изымаются из употребления.

Стандарт мутности необходимо обновлять или проверять его оптическую плотность ежемесячно.

4.2. Методы серийных разведений

4.2.1. Приготовление растворов АБП для методов серийных разведений

Общим и крайне важным этапом для всех методов серийных разведений является приготовление растворов АБП. Различают «основные» растворы АБП (пригодные для хранения) и «рабочие» — те, которые необходимо использовать «ех tempore» для приготовления питательных сред.

Для приготовления основных растворов АБП необходимо использовать субстанции АБП с известной активностью, лекарственные формы не пригодны. Для взвешивания субстанций необходимо использовать электронные лабораторные весы с точностью до 4 знака, для измерения объемов — калиброванные дозаторы и пипетки.

Источник