Санитарно бактериологический анализ почвы включает

Санитарно бактериологический анализ почвы включает

Санитарно-бактериологическое исследование почвы — Н. А. Бельская

Почва является основным местом обитания многих микроорганизмов (см. главу 6). Из почвы микробы поступают в воду и обсеменяют воздух.

Микробиологическое исследование почвы имеет важное значение. Оно проводится при выборе участка для строительства детских учреждений, спортивных площадок, больниц, госпиталей, военных лагерей, водопроводных сооружений и других объектов.

Санитарно-микробиологический анализ почвы включает определение:

1) общего количества бактерий в 1 г почвы;

2) титра санитарно-показательных микроорганизмов БГКП и С. perfringens;

3) термофильных бактерий в 1 г почвы;

4) по эпидемиологическим показаниям проводится исследование на наличие патогенных микроорганизмов (сальмонелл, шигелл, клостридий столбняка, ботулизма, некоторых вирусов и др.).

Отбор проб почвы. Выбор места для отбора проб почвы определяется санитарным врачом и бактериологом в зависимости от цели и задачи исследования. На обследуемой территории до 1000 м 2 выделяют два участка площадью 25 м 2 . Один должен быть расположен близ источников загрязнения (свалки, мусорные ящики, выгребные ямы и т. д.), другой — в отдалении от них (контроль). На каждом участке в 25 м 2 намечают для отбора проб пять точек: четыре по углам и одна в центре или пять точек по диагонали участка.

Для исследования поверхностного слоя почвы пробы отбирают стерильной лопаткой или совком на глубине до 20 см. Из отдельных точек участка лопаткой выкапывают цельный кусок почвы. Стерильным ножом снимают верхний слой толщиной 1,5-2,0 см и из середины куска набирают стерильной ложкой 200-300 г почвы. Смешанный образец, составленный из пяти отдельно взятых проб почвы, должен весить не менее 1 кг.

При исследовании образцов из глубинных слоев почвы (от 0,75 до 2 м) пользуются специальным буром с полостью. На заданной глубине полость бура открывается, наполняется почвой, затем механически закрывается, и бур извлекают на поверхность.

Пробы почвы, взятые для анализа, переносят в стерильные банки с ватно-марлевыми пробками и покрывают стерильной пергаментной бумагой. К каждой банке приклеивают этикетку с указанием даты и номера пробы. В сопроводительном документе отмечают характер почвы, расположение источников загрязнения, площадь обследуемой территории, данные, характеризующие климат местности и т. п.

Все пробы помещают в деревянный ящик с гнездами и немедленно транспортируют в лабораторию. Если нет возможности приступить к исследованию почвы в тот же день, то допускается хранение проб в холодильнике при 1-2° С в течение суток.

Подготовка проб почвы к исследованию. Образцы почвы, отобранные на одном участке из нескольких точек, хорошо перемешивают, освобождают от крупных включений (щебня, камней, корней, стекол). От среднего образца отделяют 200-300 г и вносят в стерильную посуду. Затем почву дробят в стерильной ступке, просеивают через стерильное сито на стерильную бумагу и берут для исследования навеску в 30 г. Навеску почвы высыпают в стерильную колбу вместимостью 500 мл и доливают 270 мл стерильной водопроводной воды, получают разведение почвы 1:10. Взбалтывают почвенную взвесь 10-15 мин и из приготовленного разведения 1:10 без отстаивания готовят ряд последовательных десятикратных разведений по общепринятой методике. При анализе чистых почв ограничиваются 3-4 разведениями (до 1:1000, 1:10000), при исследовании загрязненных почв используют разведения — до 1:100000, 1:1000000.

Определение общего количества бактерий в почве проводят аналогично исследованию воды. Показатели общего количества бактерий для различных видов почв представлены в табл. 55.

Определение БГКП как показателя фекального загрязнения проводят двумя методами: титрационным и методом мембранных фильтров.

Из первоначального разведения почвенной взвеси 1:10 стерильной пипеткой берут 10 мл, что соответствует 1 г почвы, и засевают во флаконы с 50 мл среды Кесслер. Затем из каждого разведения почвы засевают по 1 мл в пробирки с поплавками, содержащими 9 мл той же среды. Посевы выращивают в термостате 24 ч при 37° С.

Просматривают посевы (при задержке роста посевы оставляют на третьи сутки). Отсутствие газообразования и помутнения в бродильных сосудах со средой Кесслер через 48 ч позволяет дать отрицательный ответ.

При наличии в средах газообразования и помутнения или только помутнения из этих сосудов производят высев петлей на сектора среды Эндо в чашках Петри. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37° С 24 ч.

Просматривают посевы. Отсутствие роста на среде Эндо дает право на отрицательный ответ.

Если на среде Эндо вырастают типичные для кишечной палочки колонии, то из них делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба на оксидазу отрицательная, то проверяют ферментативные свойства выделенной культуры путем посева на полужидкую среду с глюкозой. Посевы помещают в термостат на 24 ч при 37° С.

Просматривают посевы. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие кишечной палочки в исследуемом разведении почвы.

Коли-титр почвы определяют по наименьшему объему, в котором обнаруживают БГКП (показатели коли-титра для различных видов почв представлены в табл. 55).

Таблица 55. Схема оценки санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям

Метод мембранных фильтров применяют при исследовании малозагрязненных почв. Через стерильные мембранные фильтры № 3 пропускают по 10 мл почвенной взвеси из разведений 1:10, 1:100, 1:1000. Дальнейший ход исследования аналогичен определению кишечных палочек в воде. Метод мембранных фильтров позволяет сократить срок исследования до двух суток. Результаты анализа выражают коли-индексом. Коли-индекс почвы — это количество кишечных палочек в 1 г почвы.

Примечание. Среда Кесслер содержит лактозу, которую сбраживают БГКП, и генциановый фиолетовый, задерживающий рост грамположительной микрофлоры.

Из всех приготовленных почвенных разведений (от 1:10 до 1:1000000) по 1 мл вносят в два параллельных ряда стерильных пробирок. Один ряд пробирок прогревают при 80° С 15 мин для освобождения от неспороносной микрофлоры. Затем во все пробирки наливают по 9 мл расплавленной и остуженной до 45° С среды Вильсона — Блера, приготовленной ex tempore. Пробирки вращают между ладонями, чтобы посевной материал равномерно распределился в питательной среде, и быстро опускают их в холодную воду для удаления кислорода и охлаждения среды. Посевы выращивают при 43° С 24 ч.

C. perfringens дает рост в глубине среды в виде черных колоний. Газообразование регистрируется по разрыву питательной среды. В мазках, приготовленных из колоний, обнаруживают грамположительные крупные палочки со спорами овальной формы, расположенные центрально или субтерминально.

Предельное разведение почвенной взвеси, которое дает на среде Вильсона — Блера рост C. perfringens, означает титр этого микроба в почве (см. табл. 55). Наличие в почве C. perfringens является косвенным показателем присутствия в ней и других клостридий — возбудителя столбняка (C. tetani), возбудителя ботулизма (C. botulinum).

В почве определяют также количество термофильных бактерий в 1 г. Почва, в которой много кишечных палочек и мало термофилов, может рассматриваться как загрязненная фекалиями.

Среда Кесслер. К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят 20-30 мин, фильтруют через вату, прибавляют 10 г лактозы и доводят объем до 1 л. Устанавливают рН 7,4-7,6. Добавляют 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового. Среду разливают в колбы и пробирки с поплавками. Стерилизуют 15 мин при давлении 0,5 атм (112° С). Среда имеет фиолетовый цвет.

Контрольные вопросы

1. В каких случаях проводят санитарно-бактериологическое исследование почвы?

2. Какие определения включают санитарно-бактериологический анализ почвы?

3. Как проводят отбор проб почвы?

4. Какими методами определяют наличие БГКП в почве?

Задания

1. Приготовьте из почвенной взвеси в разведении 1:10 ряд последовательных разведений 1:100, 1:1000,1:10000 и проведите определение микробного числа в данной пробе почвы.

2. Возьмите у преподавателя готовые посевы разведений почвы на среде Вильсона — Блера, определите титр C. perfringens. Сделайте мазки из колоний, окрасьте по Граму. Найдите под микроскопом в мазках C. perfringens и покажите преподавателю. Результаты микроскопии зарисуйте в тетрадь.

Источник

Глава 19 САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЫ

Почва является важнейшей средой обитания микроорганиз­мов, вместе с растениями и животными они составляют слож­ные и многообразные биоценозы, состав которых и функцио­нальная активность зависят в основном от типа и структуры почвы, состава минеральных и органических веществ, клима­тических условий и сезонности, физико-химического состоя­ния, интенсивности инсоляции. Существенное влияние на микробиоценоз почвы оказывает антропотехногенное воздей­ствие: вспашка, мелиорация, внесение удобрений и ядохими­катов, свалки бытовых и промышленных отходов. Почва как фактор окружающей среды может служить источником вторич­ного загрязнения подземных и поверхностных вод, атмосфер­ного воздуха и сельскохозяйственной продукции. Состав мик­рофлоры меняется в зависимости от глубины почвы. В по­верхностном слое почвы (0–10 см), как правило, количество микроорганизмов незначительно; это связано с губительным действием прямого солнечного света и низкой влажности поч­вы. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается на глубине 10–30 см. На глубине 1 м выявляются еди­ничные клетки бактерий. Наиболее богата микроорганизмами культурная возделываемая почва (до 5 млрд клеток в 1 г поч­вы), наименее – почва, бедная влагой и органическими веще­ствами (200 млн клеток в 1 г).

Оценить микробный пейзаж почвы и степень ее опасности для здоровья населения, активность протекающих процессов самоочищения можно при ведении мониторинга за балансом постоянных обитателей и состоянием микроорганизмов, попа­дающих в почву с выделениями человека и животных, для которых почва служит местом кратковременного (кишечная палочка – до 8 мес, брюшнотифозные палочки – от несколь­ких дней до 3 мес, шигеллы – от 14 до 100 дней) или длитель­ного пребывания (спорообразующие бактерии – сибиреязвен­ная палочка, возбудитель столбняка и газовой гангрены – го­дами и десятилетиями).

Необходимо отметить, что с увеличением химической на­грузки на почву нарушается баланс микроорганизмов, увели­чивается количество положительных находок патогенных бак­терий и геогельминтов, которые являются более устойчивыми, чем представители почвенных бактерий, в связи с чем возрас­тает эпидемическая опасность почвы для человека и животных.

Санитарно-гигиенический надзор за состоянием почвы предусматривает определение и прогноз степени их опасности для здоровья людей в населенных пунктах, а также разработку мероприятий по их рекультивации, профилактике инфекцион­ной и неинфекционной заболеваемости, схем районной пла­нировки и охраны водосборных территорий. Результаты над­зора учитывают при решении очередности оздоровительных мероприятий в рамках комплексных природоохранных про­грамм, оценке эффективности реабилитационных и санитарно-экологических мероприятий и текущего санитарного кон­троля за объектами, прямо или косвенно воздействующими на окружающую среду населенного пункта.

Группа почвенных микроорганизмов (спорообразующие бак­терии, актиномицеты, грибы, нитрифицирующие бактерии и др.) принимает участие в круговороте азота, серы и фосфора, а также в процессах самоочищения почвы.

Оценка санитарного состояния почвы проводится по ре­зультатам анализов почв на объектах повышенного риска (дет­ские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т.п.) и в санитарно-защитных зонах по следующим индикаторным показателям:

– косвенным показателям, характеризующим интенсивность биологической нагрузки на почву. Это санитарно-показа-тельные микроорганизмы бактерий группы кишечной па­лочки (БГКП) – общие колиформные бактерии (ОКБ) и фекальные энтерококки (индекс энтерококков). В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика и как следствие высоки индексы санитарно-показательных микроорганизмов, что наряду с санитарно-химическими показателями (динамика аммиака и нитратов, санитарное число) свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфициро­вания. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое со­держание вегетативных форм С.perfringens. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели;

– прямым санитарно-бактериологическим показателям эпиде­мической опасности почвы – обнаружением возбудителей кишечных инфекций (возбудители кишечных инфекций, патогенные энтеробактерии, энтеровирусы).

Оценка эпидемической опасности почв населенных пунктов (табл. 19.1). При отсутствии возможности прямого определения в почвах энтеробактерии и энтеровирусов оценка безопасности может быть проведена ориентировочно по индикаторным мик­роорганизмам.

Почву оценивают как чистую без ограничений по санитар­но-бактериологическим показателям при отсутствии патоген­ных бактерий и индексе санитарно-показательных микроорга­низмов до 10 клеток на 1 г почвы. При загрязнении почвы сальмонеллами индекс санитарно-показательных организмов БГКП и эктерококков достигает 10 клеток на 1 г почвы и более. Концентрация колифага в почве на уровне 10 БОЕ/г и более также свидетельствует о загрязнении почвы.

Показатели биологической активности почвы. Исследования биологической активности почвы проводятся при необходи­мости углубленной оценки ее санитарного состояния и спо­собности к самоочищению.

Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), численность основных групп почвенных микроорга­низмов (почвенных сапрофитных бактерий, актиномицетов, почвенных микромицетов), показатели интенсивности транс­формации соединений углерода и азота в почве («дыхание» почвы, санитарное число, динамика азота аммиака и нитратов в почве, азотфиксация, аммонификация, нитрификация и де-нитрификация), динамика кислотности и окислительно-вос­становительного потенциала в почве, активность ферментатив­ных систем и другие показатели.

Перечень показателей определяется целью исследования. На первом этапе исследований целесообразно использование наиболее простых и быстро определяемых информативных ин­тегральных показателей: «дыхание» почвы, общая микробная численность, окислительно-восстановительный потенциал и кислотность почв, динамика азота аммиака и нитратов. Даль­нейшее углубленное исследование проводится в соответствии с полученными результатами и общими задачами исследова­ния.

Так, почву можно считать «незагрязненной» по показателям биологической активности при изменении микробиологичес­ких показателей не более 50 % и биохимических – не более 25% по сравнению с такими же показателями для контроль­ных, принятых в качестве чистых, незагрязненных почв.

Отбор проб для бактериологического анализа проводится не реже 1 раза в год в местах возможного нахождения людей, животных, в местах загрязнения органическими отходами. При изучении динамики самоочищения почвы отбор проб осущест­вляют в течение первого месяца еженедельно, а затем ежеме­сячно в течение вегетационного периода до завершения актив­ной фазы самоочищения.

При выборе объектов в первую очередь обследуют почвы территорий повышенного риска воздействия на здоровье насе­ления (детские дошкольные, школьные и лечебные учрежде­ния, селитебные территории, зоны санитарной охраны водо­емов, питьевого водоснабжения, земли, занятые под сельхоз­культуры, рекреационные зоны и т.д.). На данных объектах отбор проб проводится 2 раза в год, размер пробной площад­ки – не более 5×5 м. На территории детских учреждений и игровых площадок пробы отбирают отдельно из песочниц и с общей территории с глубины 0–10 см.

Из каждой песочницы или с игровой территории отбирает­ся одна объединенная проба, составленная из 5 точечных проб. Допускается отбор изо всех песочниц или со всех игро­вых территорий каждой возрастной группы одной объединен­ной пробы, составленной из 8–10 точечных проб загрязнения почв.

Санитарно-бактериологический контроль почв населенных пунктов проводится с учетом функциональных зон города. Места отбора проб предварительно отмечаются на картосхеме, отражающей структуру городского ландшафта. Пробная пло­щадка (часть исследуемой территории, характеризующаяся сход­ными условиями, рельефом, однородностью структуры почвы и растительного покрова, характером хозяйственного исполь­зования) должна располагаться на типичном для изучаемой территории месте. При неоднородности рельефа площадки вы­бирают по элементам рельефа. На территорию, подлежащую контролю, составляют описание с указанием адреса, точки отбора, общего рельефа микрорайона, расположения мест от­бора и источников загрязнения, растительного покрова, характера землепользования, уровня грунтовых вод, типа почвы и других данных, необходимых для правильной оцен­ки и трактовки ре­зультатов анализов об­разцов.

При контроле за за­грязнением почв про­мышленными источ­никами площадки для отбора проб распола­гают на площади трех­кратной величины санитарно-защитной зо­ны вдоль векторов розы ветров на расстоянии 100, 200, 300, 500, 1000, 2000, 5000 м и более от источника загрязнения (ГОСТ 17.4.4.02-84).

При изучении загрязнения почв в районе транспортных магистралей пробные площадки закладывают на придорожных полосах с учетом рельефа местности, растительного покрова, метео- и гидрологических условий. Пробы почвы отбирают с узких полос длиной 200–500 м на расстоянии 0–10, 10–50, 50–100 м от полотна дороги. Одна смешанная проба состав­ляется из 20–25 точечных, отобранных с глубины 0–10 см.

При оценке сельскохозяйственных территорий пробы почвы отбирают 2 раза в год (весна, осень) с глубины 0–25 см. На каждые 0–15 га закладывается не менее одной площадки раз­мером 100–200 м2 в зависимости от рельефа местности и условий землепользования. Для взятия проб применяют бур Некрасова (рис. 19.1).

На территории крупных городов с многочисленными источ­никами загрязнения проводят геохимическое картирование по сети апробирования. Для выявления очагов загрязнения ре­комендуемая плотность отбора 1–5 проб на 1 км 2 с расстоя­нием между точками отбора 400–1000 м. Для дальнейшего выделения территории с максимальной степенью загрязнения сеть апробирования сгущается до 25–30 проб на 1 км 2 с рас­стоянием между точками отбора около 200 м. Пробы отбирают с глубины 0–5 см.

Точечные пробы отбирают в соответствии с ГОСТом 17.4.4.02-84, с соблюдением стерильности для санитарно-микробиологических исследований методом конвертов. Объединенную пробу составляют из равных по объему точечных проб (не менее 5), отобранных на одной площадке. Объединенные про­бы упаковывают в чистые полиэтиленовые пакеты, закрывают, маркируют, регистрируют в журнале отбора проб и пронуме­ровывают. На каждую пробу составляют сопроводительный талон, вместе с которым пробу вкладывают во второй внешний пакет, что обеспечивает целостность и безопасность их транс­портирования. Время от отбора проб до начала их исследова­ний не должно превышать 1 сут. В лаборатории пробу осво­бождают от посторонних примесей, доводят до воздушно-су­хого состояния, тщательно перемешивают и делят на части для проведения анализа. Отдельно оставляют контрольную часть от каждой анализируемой пробы (около 200 г) и хранят в холодильнике 2 нед на случай арбитража.

Подготовка и обработка почвы для анализа. Для приготов­ления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, перемешивают и распределяют в форме квадрата, диагоналя­ми почву делят на 4 треугольника, почву из двух противопо­ложных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь пере­мешивают и далее повторяется приведенная выше процедура до тех пор, пока не останется 0,5 кг почвы. Перед посевом почву просеивают через сито диаметром 3 мм.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбира­ют навески, величины которых выбирают исходя из предпола­гаемой степени загрязнения почвы и планируемых определе­ний. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навес­ки от 1 до 10 г. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде (например, 1 г почвенной суспензии раз­водят в 10 мл стерильной водопроводной воды, 10 г почвы – в 100 мл воды и т.д.). После приготовления разведений при­меняют соответствующую предварительную обработку почвы с целью извлечения клеток микроорганизмов из почвенных агре­гатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц при помощи:

• 10-минутного вертикального встряхивания почвенной сус­пензии первого разведения в пробирках с резиновыми проб­ками;
• 3-минутной обработки почвенной суспензии первого разве­дения на мешалке механического диспергатора (размельчитель тканей марки РТ-2) – при навеске почвы более 1 г.

Почву разводят до 0,0001–0,00001 г/мл (10 -4 –10 -5 ). При­готовленные разведения используются для посева на различ­ные питательные среды, а также для учета численности мик­роорганизмов методом прямой микроскопии.

Источник