Санитарно микробиологическое исследование почвы характер загрязнения

Санитарно микробиологическое исследование почвы характер загрязнения

Почва представляет собой наиболее насыщенный микроорганизмами биотоп, отличающийся стабильностью состава микрофлоры. На формирование микробных почвенных биоценозов, имеющих в том числе и санитарное значение, на их качественный и количественный состав влияет множество факторов.

• Тип почвы и степень её окультуренности. Чем она выше, тем больше общая микробная обсеменённость. Соответственно, исходный «нормальный» показатель ОМЧ для разных почв различен.

• Физико-химические свойства почвы: структурированность, аэрация, влажность, водопроницаемость, наличие свободного и связанного кислорода.

• Возраст, географическое расположение почвы. В направлении с юга на север содержание органических веществ в ней, а соответственно, и микроорганизмов уменьшается.

• Климатические условия и сезонность. Весной в почве преобладают анаэробные, летом — с порообразующие бактерии. К концу лета увеличивается содержание актиномицетов, усваивающих органические вещества, не утилизированные бактериями. Биологическая активность всех почвенных микроорганизмов увеличивается осенью и заметно снижается в зимний период.

• Глубина почвенного слоя. В толще почвы выделяют три основных горизонта: А (0-10 см), В (10-20 см) и С (20-30 см). На поверхности и в горизонте А микроорганизмов мало вследствие низкой влажности и микробицидного действия прямого солнечного света. В необработанной почве горизонта А их содержание наиболее велико на глубине 5-10 см (то есть в зоне, пограничной с горизонтом В). В обработанной почве микроорганизмов особенно много на границе горизонтов В и С. На глубине 1 м выделяют единичные микроорганизмы. Виды, выделяемые на глубине 4 м и более, рассматривают не как почвенные, а как имеющие геологическое значение.

Источник

Глава 19 САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЫ

Почва является важнейшей средой обитания микроорганиз­мов, вместе с растениями и животными они составляют слож­ные и многообразные биоценозы, состав которых и функцио­нальная активность зависят в основном от типа и структуры почвы, состава минеральных и органических веществ, клима­тических условий и сезонности, физико-химического состоя­ния, интенсивности инсоляции. Существенное влияние на микробиоценоз почвы оказывает антропотехногенное воздей­ствие: вспашка, мелиорация, внесение удобрений и ядохими­катов, свалки бытовых и промышленных отходов. Почва как фактор окружающей среды может служить источником вторич­ного загрязнения подземных и поверхностных вод, атмосфер­ного воздуха и сельскохозяйственной продукции. Состав мик­рофлоры меняется в зависимости от глубины почвы. В по­верхностном слое почвы (0–10 см), как правило, количество микроорганизмов незначительно; это связано с губительным действием прямого солнечного света и низкой влажности поч­вы. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается на глубине 10–30 см. На глубине 1 м выявляются еди­ничные клетки бактерий. Наиболее богата микроорганизмами культурная возделываемая почва (до 5 млрд клеток в 1 г поч­вы), наименее – почва, бедная влагой и органическими веще­ствами (200 млн клеток в 1 г).

Оценить микробный пейзаж почвы и степень ее опасности для здоровья населения, активность протекающих процессов самоочищения можно при ведении мониторинга за балансом постоянных обитателей и состоянием микроорганизмов, попа­дающих в почву с выделениями человека и животных, для которых почва служит местом кратковременного (кишечная палочка – до 8 мес, брюшнотифозные палочки – от несколь­ких дней до 3 мес, шигеллы – от 14 до 100 дней) или длитель­ного пребывания (спорообразующие бактерии – сибиреязвен­ная палочка, возбудитель столбняка и газовой гангрены – го­дами и десятилетиями).

Необходимо отметить, что с увеличением химической на­грузки на почву нарушается баланс микроорганизмов, увели­чивается количество положительных находок патогенных бак­терий и геогельминтов, которые являются более устойчивыми, чем представители почвенных бактерий, в связи с чем возрас­тает эпидемическая опасность почвы для человека и животных.

Санитарно-гигиенический надзор за состоянием почвы предусматривает определение и прогноз степени их опасности для здоровья людей в населенных пунктах, а также разработку мероприятий по их рекультивации, профилактике инфекцион­ной и неинфекционной заболеваемости, схем районной пла­нировки и охраны водосборных территорий. Результаты над­зора учитывают при решении очередности оздоровительных мероприятий в рамках комплексных природоохранных про­грамм, оценке эффективности реабилитационных и санитарно-экологических мероприятий и текущего санитарного кон­троля за объектами, прямо или косвенно воздействующими на окружающую среду населенного пункта.

Группа почвенных микроорганизмов (спорообразующие бак­терии, актиномицеты, грибы, нитрифицирующие бактерии и др.) принимает участие в круговороте азота, серы и фосфора, а также в процессах самоочищения почвы.

Оценка санитарного состояния почвы проводится по ре­зультатам анализов почв на объектах повышенного риска (дет­ские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т.п.) и в санитарно-защитных зонах по следующим индикаторным показателям:

– косвенным показателям, характеризующим интенсивность биологической нагрузки на почву. Это санитарно-показа-тельные микроорганизмы бактерий группы кишечной па­лочки (БГКП) – общие колиформные бактерии (ОКБ) и фекальные энтерококки (индекс энтерококков). В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика и как следствие высоки индексы санитарно-показательных микроорганизмов, что наряду с санитарно-химическими показателями (динамика аммиака и нитратов, санитарное число) свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфициро­вания. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое со­держание вегетативных форм С.perfringens. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели;

– прямым санитарно-бактериологическим показателям эпиде­мической опасности почвы – обнаружением возбудителей кишечных инфекций (возбудители кишечных инфекций, патогенные энтеробактерии, энтеровирусы).

Оценка эпидемической опасности почв населенных пунктов (табл. 19.1). При отсутствии возможности прямого определения в почвах энтеробактерии и энтеровирусов оценка безопасности может быть проведена ориентировочно по индикаторным мик­роорганизмам.

Почву оценивают как чистую без ограничений по санитар­но-бактериологическим показателям при отсутствии патоген­ных бактерий и индексе санитарно-показательных микроорга­низмов до 10 клеток на 1 г почвы. При загрязнении почвы сальмонеллами индекс санитарно-показательных организмов БГКП и эктерококков достигает 10 клеток на 1 г почвы и более. Концентрация колифага в почве на уровне 10 БОЕ/г и более также свидетельствует о загрязнении почвы.

Показатели биологической активности почвы. Исследования биологической активности почвы проводятся при необходи­мости углубленной оценки ее санитарного состояния и спо­собности к самоочищению.

Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), численность основных групп почвенных микроорга­низмов (почвенных сапрофитных бактерий, актиномицетов, почвенных микромицетов), показатели интенсивности транс­формации соединений углерода и азота в почве («дыхание» почвы, санитарное число, динамика азота аммиака и нитратов в почве, азотфиксация, аммонификация, нитрификация и де-нитрификация), динамика кислотности и окислительно-вос­становительного потенциала в почве, активность ферментатив­ных систем и другие показатели.

Перечень показателей определяется целью исследования. На первом этапе исследований целесообразно использование наиболее простых и быстро определяемых информативных ин­тегральных показателей: «дыхание» почвы, общая микробная численность, окислительно-восстановительный потенциал и кислотность почв, динамика азота аммиака и нитратов. Даль­нейшее углубленное исследование проводится в соответствии с полученными результатами и общими задачами исследова­ния.

Так, почву можно считать «незагрязненной» по показателям биологической активности при изменении микробиологичес­ких показателей не более 50 % и биохимических – не более 25% по сравнению с такими же показателями для контроль­ных, принятых в качестве чистых, незагрязненных почв.

Отбор проб для бактериологического анализа проводится не реже 1 раза в год в местах возможного нахождения людей, животных, в местах загрязнения органическими отходами. При изучении динамики самоочищения почвы отбор проб осущест­вляют в течение первого месяца еженедельно, а затем ежеме­сячно в течение вегетационного периода до завершения актив­ной фазы самоочищения.

При выборе объектов в первую очередь обследуют почвы территорий повышенного риска воздействия на здоровье насе­ления (детские дошкольные, школьные и лечебные учрежде­ния, селитебные территории, зоны санитарной охраны водо­емов, питьевого водоснабжения, земли, занятые под сельхоз­культуры, рекреационные зоны и т.д.). На данных объектах отбор проб проводится 2 раза в год, размер пробной площад­ки – не более 5×5 м. На территории детских учреждений и игровых площадок пробы отбирают отдельно из песочниц и с общей территории с глубины 0–10 см.

Из каждой песочницы или с игровой территории отбирает­ся одна объединенная проба, составленная из 5 точечных проб. Допускается отбор изо всех песочниц или со всех игро­вых территорий каждой возрастной группы одной объединен­ной пробы, составленной из 8–10 точечных проб загрязнения почв.

Санитарно-бактериологический контроль почв населенных пунктов проводится с учетом функциональных зон города. Места отбора проб предварительно отмечаются на картосхеме, отражающей структуру городского ландшафта. Пробная пло­щадка (часть исследуемой территории, характеризующаяся сход­ными условиями, рельефом, однородностью структуры почвы и растительного покрова, характером хозяйственного исполь­зования) должна располагаться на типичном для изучаемой территории месте. При неоднородности рельефа площадки вы­бирают по элементам рельефа. На территорию, подлежащую контролю, составляют описание с указанием адреса, точки отбора, общего рельефа микрорайона, расположения мест от­бора и источников загрязнения, растительного покрова, характера землепользования, уровня грунтовых вод, типа почвы и других данных, необходимых для правильной оцен­ки и трактовки ре­зультатов анализов об­разцов.

При контроле за за­грязнением почв про­мышленными источ­никами площадки для отбора проб распола­гают на площади трех­кратной величины санитарно-защитной зо­ны вдоль векторов розы ветров на расстоянии 100, 200, 300, 500, 1000, 2000, 5000 м и более от источника загрязнения (ГОСТ 17.4.4.02-84).

При изучении загрязнения почв в районе транспортных магистралей пробные площадки закладывают на придорожных полосах с учетом рельефа местности, растительного покрова, метео- и гидрологических условий. Пробы почвы отбирают с узких полос длиной 200–500 м на расстоянии 0–10, 10–50, 50–100 м от полотна дороги. Одна смешанная проба состав­ляется из 20–25 точечных, отобранных с глубины 0–10 см.

При оценке сельскохозяйственных территорий пробы почвы отбирают 2 раза в год (весна, осень) с глубины 0–25 см. На каждые 0–15 га закладывается не менее одной площадки раз­мером 100–200 м2 в зависимости от рельефа местности и условий землепользования. Для взятия проб применяют бур Некрасова (рис. 19.1).

На территории крупных городов с многочисленными источ­никами загрязнения проводят геохимическое картирование по сети апробирования. Для выявления очагов загрязнения ре­комендуемая плотность отбора 1–5 проб на 1 км 2 с расстоя­нием между точками отбора 400–1000 м. Для дальнейшего выделения территории с максимальной степенью загрязнения сеть апробирования сгущается до 25–30 проб на 1 км 2 с рас­стоянием между точками отбора около 200 м. Пробы отбирают с глубины 0–5 см.

Точечные пробы отбирают в соответствии с ГОСТом 17.4.4.02-84, с соблюдением стерильности для санитарно-микробиологических исследований методом конвертов. Объединенную пробу составляют из равных по объему точечных проб (не менее 5), отобранных на одной площадке. Объединенные про­бы упаковывают в чистые полиэтиленовые пакеты, закрывают, маркируют, регистрируют в журнале отбора проб и пронуме­ровывают. На каждую пробу составляют сопроводительный талон, вместе с которым пробу вкладывают во второй внешний пакет, что обеспечивает целостность и безопасность их транс­портирования. Время от отбора проб до начала их исследова­ний не должно превышать 1 сут. В лаборатории пробу осво­бождают от посторонних примесей, доводят до воздушно-су­хого состояния, тщательно перемешивают и делят на части для проведения анализа. Отдельно оставляют контрольную часть от каждой анализируемой пробы (около 200 г) и хранят в холодильнике 2 нед на случай арбитража.

Подготовка и обработка почвы для анализа. Для приготов­ления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, перемешивают и распределяют в форме квадрата, диагоналя­ми почву делят на 4 треугольника, почву из двух противопо­ложных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь пере­мешивают и далее повторяется приведенная выше процедура до тех пор, пока не останется 0,5 кг почвы. Перед посевом почву просеивают через сито диаметром 3 мм.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбира­ют навески, величины которых выбирают исходя из предпола­гаемой степени загрязнения почвы и планируемых определе­ний. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навес­ки от 1 до 10 г. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде (например, 1 г почвенной суспензии раз­водят в 10 мл стерильной водопроводной воды, 10 г почвы – в 100 мл воды и т.д.). После приготовления разведений при­меняют соответствующую предварительную обработку почвы с целью извлечения клеток микроорганизмов из почвенных агре­гатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц при помощи:

• 10-минутного вертикального встряхивания почвенной сус­пензии первого разведения в пробирках с резиновыми проб­ками;
• 3-минутной обработки почвенной суспензии первого разве­дения на мешалке механического диспергатора (размельчитель тканей марки РТ-2) – при навеске почвы более 1 г.

Почву разводят до 0,0001–0,00001 г/мл (10 -4 –10 -5 ). При­готовленные разведения используются для посева на различ­ные питательные среды, а также для учета численности мик­роорганизмов методом прямой микроскопии.

Источник

ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I — Л. В. Красникова — 2016

13. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЧВЫ

Цель работы: провести микробиологическое исследование почвы как источника контаминации пищевых продуктов посторонними микроорганизмами.

Почва обильно заселена микроорганизмами. В ней встречаются все формы микроорганизмов, которые существуют на Земле: бактерии, вирусы, актиномицеты, дрожжи, грибы, простейшие. Общее микробное число (ОМЧ) в 1 г почвы может достигать от 1,0 до 10 млрд. В разных слоях почвы количество микроорганизмов неодинаково. В самом верхнем слое (0,5 см) микроорганизмов очень мало. На глубине от 1-5 см до 30-40 см число микроорганизмов максимально — в среднем от 10 до 50 млн в 1 г. После 30-40 см глубины ОМЧ постепенно снижается и в более глубоких слоях оно минимально.

Микрофлору почвы делят на 2 группы:

1) аутотрофная — питается минеральными веществами;

2) гетеротрофная — питается органическими веществами.

Обе группы участвуют в процессах самоочищения почв, их минерализации. Однако в группе гетеротрофных микроорганизмов может присутствовать патогенная микрофлора. При загрязнении почвы фекалиями людей, больных кишечными инфекциями, продукты растительного происхождения могут быть контаминированы возбудителями дизентерии, холеры, брюшного тифа, сальмонеллеза, энтеровирусами. Установлена прямая зависимость между уровнем заболеваемости человека и животных кишечными инфекциями и неудовлетворительным санитарным состоянием почвы. Через почву передаются возбудители таких инфекционных заболеваний, как сибирская язва, газовая гангрена, столбняк и др.

При санитарно-микробиологическом анализе почвы определяют общее микробное число, колититр, перфрингенс-титр, титр нитрифицирующих бактерий и количество протеев и термофильных бактерий. Микробное число характеризует загрязненность почвы органическими веществами. Присутствие в почве бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о ее фекальном загрязнении. Обнаружение в почве палочки Clostridium perfringens также указывает на ее фекальное загрязнение. Наличие в почве бактерий рода Proteus дает основание считать возможным загрязнение почвы органическими веществами животного происхождения или фекалиями человека. Присутствие термофильных микроорганизмов указывает на загрязнение почвы навозом или компостами. В чистых почвах термофильные микроорганизмы, как правило, не обнаруживаются.

Взятие проб почвы. При проведении микробиологических исследований поверхностных слоев почвы образцы берут на глубине 15-20 см, снимая верхний слой толщиной 2 см (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб). Отбирают пробы маленькой железной лопаткой или совком в стерильные широкогорлые банки, завернутые в бумагу и снабженные этикеткой. Каждый взятый образец должен весить 200-300 г, а смешанный образец (средняя проба) — не менее 1 кг.

Подготовка почвы для анализа. Образцы почвы освобождают от крупных включений, размельчают, просеивают через стерильное 3-миллиметровое сито, затем пробу почвы высыпают на стерильную бумагу, тщательно перемешивают и отвешивают 10 г. Навеску почвы помещают в колбу емкостью 250 см с 90 см стерильной водопроводной воды. Получают разведение 1:10, которое соответствует 0,1 г исследуемой почвы. Колбу встряхивают в течение 10 мин, дают отстояться грубым частицам почвы в течение 30 с и затем делают от 3 до 6 десятикратных разведений в зависимости от загрязненности почвы.

13.1. Определение микробного числа почвы

В две стерильные чашки Петри, слегка приоткрыв крышку, вносят по 1 см 3 10 -4 и 10 -5 разведений почвенной суспензии и затем заливают их расплавленным и охлажденным до 45 °С питательным агаром (МПА или картофельно-глюкозный агар). После застывания агара чашки помещают в термостат на 24-48 ч при температуре 37±2 °С, а затем выдерживают столько же при комнатной температуре. Подсчитывают число выросших на чашках колоний и определяют микробное число в 1 г почвы с учетом засеянного разведения.

13.2. Определение колититра почвы

Наличие бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о свежем фекальном загрязнении почвы. Титром кишечной палочки (колититр) называют наименьшее количество почвы (в г), в котором обнаруживаются кишечные палочки. Колииндексом почвы называют количество кишечных палочек в 1 г почвы.

Для определения колититра по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -5 засевают в пробирки со средой Кесслера, в которых находятся поплавки. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 ч, после чего отмечают накопление газа в поплавках.

13.3. Определение перфрингенс-титра почвы

Перфрингенс-титр — титр грамположительных облигатноанаэробных спорообразующих палочек, восстанавливающих сульфиты. Присутствие С. perfringens (споровых форм) свидетельствует о давнем фекальном загрязнении.

Для определения перфрингенс-титра используют железосульфитный агар (среда Вильсона-Блера). Обнаружение С. perfringens на этой среде основано на способности данного микроорганизма восстанавливать Na₂S₂O₃ до _Na2S, который, взаимодействуя с хлорным железом, приводит к образованию сернистого железа (FeS), имеющего черный цвет.

Пробирки с разведениями почвенной суспензии прогревают на водяной бане с температурой 80-85 °С в течение 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и засевают по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -4 в пробирки с расплавленной и охлажденной до 45 °С средой Вильсона-Блера. Вращением пробирки между ладонями почвенную суспензию равномерно распределяют в среде, после чего пробирки охлаждают в проточной водопроводной воде до застывания агара. Посевы инкубируют в течение 18-24 ч при температуре 43 °С. О наличии С. perfringens судят по росту черных колоний в пробирках со средой.

13.4. Определение количества термофильных микроорганизмов в почве

Для определения индекса термофильных бактерий в стерильные чашки Петри вносят по 1 см 3 разведений почвенной суспензии от 10 -1 до 10 -3 , заливают их расплавленным и охлажденным до 45 °С МПА. После застывания агара чашки инкубируют в течение 24 ч при температуре 60 °С, после чего подсчитывают число выросших колоний и определяют количество термофильных бактерий в 1 г почвы с учетом разведения.

13.5. Обнаружение в почве палочек протея

Бактерии рода Proteus попадают из почвы на пищевые продукты и при благоприятных условиях размножаются в них. Продукты жизнедеятельности палочек протея могут вызвать пищевое отравление.

Для обнаружения в почве палочек протея по методу Шукевича в конденсационную воду свежескошенного МПА вносят 0,1 см 3 соответствующего разведения почвенной суспензии. Пробирки выдерживают в течение 24-48 ч в термостате при температуре 37 °С, после чего регистрируют рост протеев по образованию тонкой вуалевидной пленки на скошенной поверхности агара. При наличии такой пленки готовят микроскопический препарат с ее поверхности, окрашивают его по Граму, определяют подвижность и способность образовывать H₂S.

Результаты санитарно-микробиологического исследования почвы анализируют и дают ей оценку, пользуясь данными, приведенными в табл. 13.1.

Таблица 13.1. Схема оценки санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям

Источник