Синтетическая среда используемая для выращивания культур клеток

Специальные питательные среды для культур клеток.

Используются разнообразные синтетические вирусологические питательные среды сложного состава, включающие большой набор различных факторов роста — среда 199, Игла, раствор Хэнкса, гидролизат лактальбумина. В среды добавляют стабилизаторы рН (Hepes), различные в видовом отношении сыворотки крови (наиболее эффективной считают эмбриональную телячью сыворотку), L-цистеин и L-глютамин.

В зависимости от функционального использования среды могут быть ростовые (с большим содержанием сыворотки крови) — их используют для выращивания клеточных культур до внесения вирусных проб, и поддерживающие (с меньшим содержанием сыворотки или ее отсутствием) — для содержания инфицированных вирусом клеточных культур.

Выявляемые проявления вирусной инфекции клеточных культур:

1.) Цитопатический эффект. Цитопатогенное действие (ЦПД) вирусов – видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов.

2.) Выявление телец включений. Включения – скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца Гварниери, вирусы герпеса и аденовирусы – внутриядерные включения.

3.) Выявление вирусов методом флюоресцирующих антител (МФА), электронной микроскопией, авторадиографией.

4.) Цветная проба. Обычный цвет используемых культуральных сред, содержащих в качестве индикатора рН феноловый красный, при оптимальных для клеток условиях культивирования (рН около 7,2) — красный. Размножение клеток меняет рН и соответственно — цвет среды с красного на желтый за счет смещения рН в кислую сторону. При размножении в клеточных культурах вирусов происходит лизис клеток, изменения рН и цвета среды не происходит.

5.) Выявление гемагглютинина вирусов — гемадсорбция, гемагглютинация. Эти реакции основаны на способности некоторых вирусов вызвать агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счёт вирусных гликопротеиновых шипов – гемагглютининов.

6.) Метод бляшек (бляшкообразования). В результате цитолитического действия многих вирусов на клеточные культуры образуются зоны массовой гибели клеток. Выявляют бляшки — вирусные “ клеточно — негативные” колонии – ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной «бляшки». Метод «бляшек» используют для дифференциации вирусов и определения их концентрации.

Заражение лабораторных животных. Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей. Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) — путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение. При первичном заражении животные могут не заболеть, поэтому через 5-7 дней внешне здоровых животных выводят из эксперимента, а из их органов готовят суспензии, которыми заражают следующие партии животных. Эти последовательные заражения называются «пассажами».

Индикацию, т.е. обнаружение факта репликации вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка — гемагглютинина. В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено, в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных научных целях.

Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы выращивают в инкубаторе 7—10 дней, а затем используют для культивирования. В этой модели все типы зачатков тканей подвержены заражению. Но не все вирусы могут размножаться и развиваться в куриных эмбрионах. К достоинствам модели относятся возможность накопления вирусов в больших количествах, стерильность объекта, отсутствие скрытых вирусных инфекций, простота техники работы. Для культивирования вирусов исследуемый материал вводят в различные полости и ткани куриного зародыша. Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины — в 12, паротита — в 7-дневных куриных эмбрионах. Репродукция вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

В результате заражения могут происходить и появляться:

1) гибель эмбриона;

2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы;

3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования);

4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов).

Основные проявления цитопатического действия вирусов:

1) размножение вируса может сопровождаться гибелью клеток или морфологическими изменениями в них;

2) некоторые вирусы вызывают слияние клеток и образование многоядерного синцития;

3) клетки могут расти, но делиться, в результате чего образуются гигантские клетки;

4) в клетках появляются включения (ядерные, цитоплазматические, смешанные). Включения могут окрашиваться в розовый цвет (эозинофильные включения) или в голубой (базофильные включения);

5) если в культуре ткани размножаются вирусы, имеющие гемагглютинины, то в процессе размножения клетка приобретает способность адсорбировать эритроциты (гемадсорбция).

Источник

Приготовление сред для культивирования клеток


	Культура тканей: методы Культивирование клеток и тканей Приготовление сред для культивирования клеток Получение первично-трипсинизированных культур клеток ПРОТОКОЛ. Выделение мышиного эмбриона ПРОТОКОЛ. Извлечение куриных эмбрионов Типы первичных культур клеток Хромосомный состав, или кариотип, клеточной линии

Приготовление солевых растворов и

питательных сред для культивирования клеток

В любой клеточной культуре различают клеточную и жидкую фазы. Жидкая фаза обеспечивает жизнедеятельность клеток культуры и представляет собой питательные среды различного состава и свойств.

Все среды по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя на поверхности стекла или достаточно высокую концентрацию клеточных элементов в суспензии (при получении суспензионных культур). Поддерживающие среды фактически должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетках вирусных агентов.

Ростовые и поддерживающие среды многокомпонентны. В их состав могут входить как естественные продукты (амниотические жидкости, сыворотки животных), так и субстраты, полученные в результате частичной обработки естественных продуктов (эмбриональные экстракты, гидролизат лактальбумина, гемогидролизат, аминопептид и т. д.), а также синтетические химически чистые вещества (аминокислоты, витамины, соли).

В качестве примера питательной среды, полностью состоящей из естественных компонентов, можно назвать среду Бакли, предложенную для выращивания клеточных культур из почечного эпителия обезьян. В эту среду входит коровья амниотическая жидкость (85%), лошадиная сыворотка (10%) и коровий эмбриональный экстракт (5%).

Все естественные продукты малостандартны, их использование связано с большой опасностью микробной и вирусной контаминации клеточных культур. В связи с этим и происходит постепенное вытеснение их синтетическими стандартными смесями. Наибольшее применение находят синтетическая среда 199 и среда Игла. Широко используются среды, содержащие строго определенные количества солей, аминокислот и витаминов.

Независимо от назначения все питательные среды для тканевых культур конструируются на основе какого-либо сбалансированного солевого раствора с достаточной буферной емкостью. Чаще всего ими являются растворы Хенкса и Эрла. Эти растворы — обязательный компонент любой питательной среды. Неотъемлемым компонентом большинства ростовых сред является сыворотка животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5—10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит.

Включение сыворотки в то же время препятствует созданию ростовых сред точного химического состава, весьма важных для развития фундаментальных исследований по клеточной физиологии, так как вместе с сывороткой (или ее дериватами) вводится целый комплекс неконтролируемых факторов, варьирующих в зависимости от серии сыворотки.

В 50-е годы Ewans и Waymouth были предложены бессывороточные среды точного химического состава. Однако эти среды не обеспечивали тех показателей пролиферативной активности клеток, которые обусловливают среды с добавлением сывороток. В связи с этим представляет интерес работа Birch и Pirt, показавших, что для обеспечения интенсивного роста клеток в бессывороточных средах определяющим является включение сернокислых солей Fe, Zn, Cu, а также МnС12.

В ростовые питательные среды, а так же в буферный раствор для промывания тканей добавляют антибиотики. Их вводят в среду непосредственно перед употреблением из расчета 1 мл основного раствора антибиотиков на 500 мл среды.

Ниже приведен состав и метод приготовления одной из распространенных питательных сред, среды Игла.

Приготовление солевых растворов и питательных сред для культивирования клеток

а) Солевые растворы

Для приготовления питательных сред применяют физиологические солевые растворы, функция которых заключается в сохранении рН, осмотического давления среды и в обеспечении клеток необходимыми неорганическими веществами. Растворы готовят из химически чистых солей на высокоочищенной воде, свободной от ионов тяжелых металлов, токсичных для клеток. Используют дистиллированную воду, дважды перегнанную в стеклянных аппаратах, или воду, полученную в ионообменных колонках, нейтральной реакции. Воду получают в день приготовления растворов или накануне и хранят в стерильном стеклянном сосуде под резиновой пробкой на холоде. Предложены различные Прописи сбалансированных солевых растворов, но наиболее часто употребляют из-за простоты получения растворы Хенкса и Эрла. Для приготовления каждого раствора вначале готовят 10-кратные концентраты всех компонентов (основной раствор). Для этого в градуированную бутыль емкостью 1 л наливают 700—800 мл бидистиллированной воды и растворяют последовательно (во избежание образования труднорастворимых осадков) следующие химически чистые соли (в граммах).

Источник

Культивирование вирусов. Питательные среды, применяемые для культивирования клеточных культур. Первичные, перевиваемые и диплоидные культуры клеток

Культивирование вирусов — выращивание вирусов в искусственных условиях.

Гальтье впервые осуществил в 1879 г. культивирование вируса бешенства, заразив кролика мозгом больной собаки. Способность вируса вакцины (коровьей оспы) репродуцироваться в тканевой культуре была доказана Паркером и Наем в 1925 г. В 1931 г. Вудрафф и Э. Гудпасчер показали возможность культивирование вирусов на хорион-аллантоисной оболочке эмбрионов кур (вирус оспы птиц).

Методы культивирования:

• На лабораторных животных

• В куриных эмбрионах

• В тканевых культурах

Клеточная культура – система клеток, получаемая из ткани, находящаяся в виде слоя клеток, прикрепленных к стеклу, или в виде суспензии. Подразделяются на:

1) Первичные культуры – могут быть получены практически из любого органа (почки, легкие, кожа, тимус), однако даже при систематической смене питательной среды существуют лишь до первого пересева.

2) Стабильные (перевиваемые) линии – полностью адаптированные к существованию вне организма; их получают из нормальных и раковых тканей; размножаются неограниченно долгое время. Бывают 2 типов:

а) Нормальные клетки. В качестве стабильной культуры используют почки барана (ПКБ) и сердце обезьяны циномольгус (СОЦ);

б) Опухолевые клетки. В качестве опухолевых используют культуру клеток Hela — рак шейки матки, Hep-1 — эпидермоидный рак гортани, Дейтройт 6 — костный мозг больного раком легкого.

3) Диплоидные (эмбриональные) культуры – получаемые из эмбриональных тканей человека и животных, сохраняющие диплоидный набор хромосом до 50 пересевов.

Наиболее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.

Приготовление первичных (трипсинизированные) культур клеток. Берется орган → разрушается межклеточная ткань и происходит разобщение клеток путём воздействия на ткань протеолитических ферментов (трипсина, панкреатина) для последующего получения монослоя клеток на стекле.

В питательной среде должен присутствовать необходимый набор из неорганических ионов, аминокислот и витаминов. Различают искусственные (полусинтетические и синтетические) и естественные питательные среды.

Естественные питательные среды — это биологические жидкости (сыворотка крови, эмбриональный экстракт, асцитическая жидкость, коровья амниотическая жидкость, тканевые экстракты и др.). Питательные среды из естественных компонентов применяют редко, только для выращивания вновь изолированных тканей в начале культивирования и для поддержания очень прихотливых тканей животных.

Полусинтетические питательные среды представляют собой естественные среды, подверженные первичной ферментативной обработке. К таким средам относят гемогидролизаты, гидролизат лактальбумина, аминопептид и др.

Лучшими средами для культивирования культуры клеток являются синтетические питательные среды: 199 (содержит 60 компонентов: 10 аминокислот, 17 витаминов, 8 минеральных солей, 10 компонентов, входящих в состав нуклеиновых кислот и др.), Игла, Хенкса, Эрла (эти среды имеют аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли). Смена питательной среды проводится через 2-3 дня.

В зависимости от назначения среды подразделяются на: ростовые и поддерживающие. Ростовые применяются в первой фазе культивирования клеток, когда необходимо стимулировать клетки на максимально ускоренный рост и размножение. Они богаты питательными веществами, что способствует активному размножению клеток. Поддерживающие применяют во второй фазе культивирования клеток после заражения культуры клеток вирусами. Они поддерживают жизнеспособность клеток.

О наличии вируса в зараженной культуре клеток можно судить по цитопатическому действию (ЦПД) – это патологические изменения морфологии клеток, вплоть до их гибели, возникающие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом. Проявления ЦПД:

1. Дегенерация клеток (наблюдаются округления, изменения формы, разрушения).

2. Появление включений (Липшются – вирус герпеса; Гварниери – вирус натуральной оспы) и телец Бабеша-Негри – вирус бешенства).

3. Разрушение пласта клеток (парамиксовирусы).

4. Образование гигантских многоядерных клеток — симпластов (вирус кори).

5. Образование «негативных колоний», или «бляшкообразование» – ограниченные участки разрушенных вирусами клеток (дегенеративных клеток) в сплошном монослое культуре клеток. Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Добавление агара в питательную среду ограничивает распространение вирусов по всему монослою после выхода их из разрушенной клетки и обеспечивает взаимодействие вирусов только с соседними клетками. Каждая «бляшка» образуется потомством одного вириона. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Основные методы индикации вирусов в культуре тканей:

а. “+” гемагглютинация. Реакция гемагглютинации – склеивание эритроцитов при добавлении вирусосодержащего материала (есть вирус – эритроциты оседают в виде “зонтика”; нет вируса – в виде “диска”).

б. “+” гемадсорбция. Реакция гемадсорбции – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток и образуют характерные скопления (вирус гриппа вызывает агглютинацию эритроцитов островкового типа).

в. Реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей.

г. Цветная реакция Солка — основана на изменении цвета питательной среды. В результате жизнедеятельности клетки в питательную среду выделяются продукты клеточного метаболизма и происходит сдвиг рН в кислую сторону, о чем свидетельствует изменение цвета среды из красного в желтый. Если вирус присутствует и реплицируется в культуре, то вследствие разрушающего действия вируса клетки дегенерируются (разрушаются, т.е. их нет), и подавляется их метаболизм, т.е. цвет среды неизменяется.

Источник

➤