Способ выращивания клеток животных

Способы выращивания клеток животных

Глубинное выращивание клеток в монослое. Направлено на получение наибольшей концентрации клеток в наименьшем объеме газовой фазы. При этом клетки животных размножаются, растут и развиваются в прикрепленном состоянии до тех пор, пока не сольются в монослой. Рост клеток в виде монослоя зависит от белков – фибронектинов (от лат. fibro – нить, nectere – связывать или соединять). Фибронектин – гликопротеин, обеспечивает межклеточную адгезию, прикрепление клеток к подложке, направляет их перемещение.

Прикрепление клеток зависит от следующих свойств субстрата: гидрофильность – адгезивные свойства более выражены для смачиваемых поверхностей; протяженность – поверхность субстрата должна быть больше нормальной длины клетки; горизонтальность – растущие клетки распространяются в направлении наименьшей кривизны субстрата. Например, если принять прикрепление клеток к агар-агару за единицу, то к полиэтилену они прикрепляются лучше в 8 раз, к резине – в 12 раз, к стеклу – в 16 раз, а к стали – в 20 раз.

В монослое выращивают клетки соединительной ткани (фибробласты), клетки почек кроликов, обезьян, собак, 10-14-дневных куриных эмбрионов. Выращивание проводят в строго асептических условиях при покачивании для омывания большей площади культуральной среды. Клетки попеременно погружают в жидкую и газообразную фазу, при этом с избытком обеспечивается потребность в кислороде.

Во время культивирования клеток учитываются следующие параметры: константные – качество материала, форма и объем культиватора; вариабельные – скорость покачивания, качество и объем среды, тип клеток и размер посевного материала, рН и температура среды, снабжение кислородом и содержание СО₂ в культиваторе, окислительно-восстановительный потенциал, концентрация основных источников питания.

Глубинное выращивание клеток в суспензированных культурах. При использовании микроносителей, суспендируемых в питательной среде, площадь выращиваемых клеток увеличивается. Клетки закрепляются на их поверхности, а затем разрастаются в виде монослоя. В таких системах совмещаются монослойные и суспензионные культуры клеток животных.

Применяют следующие микроносители: положительно заряженные ДЕАЕ-сефадексы (комбинация высокомолекулярного полимера декстрана с ионообменными смолами); сефадексы с коллагеновым покрытием (высокомолекулярный полимер декстрана); отрицательно заряженный полистирол; полые стеклянные сферы; микроносители из пористого шлачного стекла и др. После выращивания клетки отделяют от микроносителей центрифугированием; фильтрованием; обработкой трипсином с последующим промыванием и сепарированием.

Данный метод применяется для получения вирусных вакцин (против бешенства, полиомиелита, ящура).

Источник

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия — КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, конструирование специальными методами клеток нового типа. Клеточная инженерия включает реконструкцию жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток, объединение двух целых клеток, принадлежащих различным видам

Клеточная инженерия связана с культивированием отдельных клеток или тканей на специальных искусственных средах|средах. Доказано, что если взять кусочки ткани и отдельные клетки из разных органов|органов, допустим|допустим, растений, хотя это возможно и у животных, и пересадить их на специальные среды|среды, содержащие минеральные соли|соли и другие вещества, то они способны расти. Это значит, что в таких изолированных от организма тканях и клетках продолжаются клеточные деления.

Новейшим методом клеточной селекции у растений, уже давшим огромный эффект, является метод|метод гаплоидов. Гаплоидные клетки имеют половинный набор хромосом. Пыльцевые зерна|зёрна (пыльца) имеют гаплоидный набор хромосом. Сейчас разработан метод|метод проращивания пыльцевых зёрен на искусственных средах|средах в пробирках и получения из них полноценных гаплоидных растений. Какое это имеет отношение к селекции? У полученных гибридов берут пыльцу, на питательных средах|средах в пробирках регенерируют из неё гаплоидные растения, а затем удваивают у них число хромосом и сразу получают полностью гомозиготные диплоидные растения. Так как мы берём пыльцу из гибридных растений и получаем через гаплоидные растения сразу гомозиготные диплоидные, то остаётся только оценить их и затем размножить лучшие.

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, совокупность методов, используемых для конструирования новых клеток. Включает культивирование и клонирование клеток на специально подобранных средах|средах, гибридизацию клеток, пересадку клеточных ядер и другие микрохирургические операции по «разборке» и «сборке» (реконструкции) жизнеспособных клеток из отдельных фрагментов.

Начало|Начало клеточной инженерии относят к 1960-м гг., когда возник метод|метод гибридизации соматических клеток. К этому времени были усовершенствованы способы культивирования животных клеток и появились способы выращивания в культуре клеток и тканей растений. Соматическую гибридизацию, т. е. получение гибридов без участия полового процесса, проводят, культивируя совместно клетки различных линий одного вида или клетки различных видов. При определённых условиях происходит слияние двух разных клеток в одну гибридную, содержащую оба генома объединившихся клеток. Удалось получить гибриды между клетками животных, далёких по систематическому положению, напр. мыши и курицы. Соматиче-ские гибриды нашли широкое применение как в научных исследованиях, так и в биотехнологии. С помощью гибридных клеток, полученных от клеток человека и мыши и человека и китайского хомячка, была проделана важная для медицины работа по картированию генов в хромосомах человека. Гибриды между опухолевыми клетками и нормальными клетками иммунной системы (лимфоцитами) – т. н. гибридомы – обладают свойствами обеих родительских клеточных линий. Подобно раковым клеткам, они способны неограниченно долго делиться на искусственных питательных средах|средах (т. е. они «бессмертны») и, подобно лимфоцитам, могут вырабатывать моноклональные (однородные) антитела|антитела определённой специфичности. Такие антитела|антитела применяют в лечебных и диагностических целях, в качестве чувствительных реагентов на различные органические вещества и т. п.

При гибридизации соматических клеток растений их предварительно освобождают от плотной клеточной оболочки, а затем проводят слияние изолированных протопластов. В этом случае, как и при гибридизации клеток животных, также удаётся преодолевать барьеры нескрещиваемости, которые существуют при обычной (половой|половой) гибридизации растений разных видов и родов|родов. Из гибридной растительной клетки на специальной среде можно вырастить клеточную массу – каллюс, дифференцирующуюся в нормальное целое растение с корнями, стеблями|стеблями и т. д. Такое гибридное растение можно высадить в землю и выращивать и размножать обычными способами. Эти методы, в отличие от традиционных, позволяют сравнительно легко и быстро получать достаточное количество генетически разнообразного исходного материала для селекции. Их применение привело, напр., к увеличению урожайности ряда культур – картофеля, цитрусовых и др.

Другое направление клеточной инженерии – манипуляции с безъядерными клетками, свободными ядрами и другими фрагментами, сводящиеся к комбинированию разнородных частей клетки. Эти эксперименты, а также микроинъекции в клетку хромосом, красителей и т. п. проводят для выяснения взаимных влияний ядра|ядра и цитоплазмы, факторов, регулирующих активность генов, и т. п.

Путём соединения клеток разных зародышей на ранних стадиях их развития выращивают мозаичных животных, или химер, состоящих из двух различающихся генотипами видов клеток. С помощью таких экспериментов изучают процессы дифференцировки клеток и тканей в ходе развития организма.

Ведущиеся уже не одно десятилетие опыты по пересадке ядер соматических клеток в лишённые ядра|ядра (энуклеированные) яйцеклетки животных с последующим выращиванием зародыша во взрослый организм с кон. 20 в. получили широкую известность как клонирование животных.

Преимущество клеточной инженерии в том, что она позволяет экспериментировать с клетками, а не с целыми организмами. Последнее гораздо сложнее, а иногда и невозможно, особенно в случае млекопитающих животных и человека или при получении отдалённых гибридов. Методы клеточной инженерии в медицине, сельском хозяйстве или биотехнологии часто применяют в сочетании с генной инженерией.

Видео по теме : Клеточная инженерия

Каждый живой организм состоит из клеток: начиная от бактерии, заканчивая высшими млекопитающими. Высшие организмы состоят из органов|органов, органы|органы состоят из тканей, ткани состоят из клеток. Всё|Все свойства любого организма определяются его геномом, который находится в клетке (в любой|любой из клеток данного организма).

По некоторым данным, геном|геном обыкновенной мухи и человека совпадают на три четверти. Ничего удивительного в этом нет. Основа генов — дезоксирибонуклеиновая кислота — ДНК — несёт всю информацию о построении всех белков и биохимии данного организма, а на долю «внешнего вида», размеров и веса|веса экземпляра биологического вида, по-видимому, отводится не так уж много. Короче говоря, Дарвин абсолютно прав, и эволюция на определённом узловом этапе связывает и муху и человека. И религии это нисколько не противоречит, поскольку она утверждает только факт создания жизни Богом, но никак не регламентирует саму технологию.

Генная и клеточная инженерия (это одно понятие) занимается вопросами связи между устройством ДНК и наследственными свойствами организмов. Конечно, она вооружена такими методами, о которых раньше, например, во времена Менделя, и мечтать не смели|смели.

Метод|Метод клеточной инженерии заключается на современном этапе в том, что специалисты получают фрагменты ДНК различных организмов и встраивают их в ДНК организма, выбранного как объект исследования. Этот метод|метод на языке учёных, обожающих специальные термины, называется экспрессией рекомбинантных ДНК. В качестве инструмента берутся рестриктазы — особые бактериальные ферменты, способные расщеплять ДНК. Их и называют образно — биологическими ножами.

Получив нужный ген (трансген), собранный из упомянутых фрагментов, встраивают его в молекулу ДНК, называемую вектором, и переносят её в клетку, где она реплицируется (размножается) самостоятельно или после объединения с «родной» хромосомой. Здесь возникают большие|большие сложности с аппаратурой, так как материал нужно ввести в микроскопическую клетку принудительно, но не нарушая её целостности. Для этого существует множество весьма изощрённых методов, поскольку естественными путями сделать этого нельзя. Разумеется, здесь нет никакой мистики, просто эволюция ничего такого не предусмотрела, напротив, поставила кучу препятствий в рамках естественного отбора.

Цель, которую несёт в себе клеточная инженерия: получение лекарств, выведение качественных сортов культурных растений, создание новых пород животных, и как высшая точка — избавление нашей цивилизации от всех болезней. Те, кто спорит (не хочется называть их мракобесами) должны иметь в виду, что один только синтетический инсулин спас и спасает миллионы диабетиков и продлевает им жизнь на десятки лет!

Опасения по поводу генной инженерии берут начало|начало с момента её рождения в 1972-ом году, когда группа П. Берга (США) синтезировала первую рекомбинантную ДНК из онкогенного вируса обезьян SV40 и E.coli. Последнее — это кишечная палочка, без которой человек не может жить. И в неё встроен вирус, вызывающий рак. Учёные в прямом смысле испугались, и даже не стали продолжать работы в тот момент. Наступил долгий период постановки исследований под строжайший контроль государства, сравнимый с контролем над работами по ядерному оружию.

К счастью, сложность и стоимость биологических генных работ сопоставима по сложности и стоимости с атомными исследованиями, и поэтому не по карману потенциальным террористам.

В действительности же клеточная инженерия это — палка о двух концах — она может дать человеку столько лет жизни, сколько он сам захочет, но может и посеять страшные несчастья для всего живого. Не спорьте, обратное не доказано, а «цена вопроса» известна. Всё|Все зависит от того, в чьих чистых или грязных руках находится клеточная инженерия. И по объективным причинам её нельзя ни запретить, ни подтолкнуть вперёд. Развитие науки подчиняется своим внутренним законам.

Источник

РОСТ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИООБЪЕКТОВ — В. М. Самыгин — 2016

ГЛАВА 12. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

Возможность сохранения живых тканей вне организма в 1885 году показал У. Ру (W. Roux), который сохранял в жизнеспособном состоянии оболочку куриного эмбриона в теплом физиологическом растворе. Позднее, в 1897 году, Леб (Loeb) поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови. Льюнгрен (1898) показал возможность поддержания эксплантатов кожи человека в жизнеспособном состоянии в кислой среде с сохранением способности к реимплантации. В 1913 году А.Каррель применил плазму крови, обогащенную экстрактом эмбриона. Этот процесс был продолжен на протяжении длительного времени и назван как культивирование «бессмертных» клеток. Таким образом, признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, датируется первым десятилетием XX века.

После того как стало известно, что подобные процессы реальны, была продемонстрирована возможность выращивания и репродукции в таких клетках фильтрующихся инфекционных агентов — вирусов и получение в больших количеств вирусного материала для применения в вакцинных препаратах. Появилась возможность встраивать в клетки специфические экзогенно полученные гены и получать их экспрессию, а также выращивать в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции стали получать из клетки, выделявшей in vitro антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости оказались одинаковыми.

Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение в различных областях исследований — от клеточной и молекулярной биологии до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии. Культуру животных тканей применяют для изучения механизмов роста и дифференцировки клеток, межтканевых и межклеточных взаимодействий, обмена веществ и т. п. Культуры животных клеток являются важными продуцентами многих биологически важных веществ. На них выращивают вирусы для их идентификации и получения вакцин. Клеточные культуры часто применяют при тестировании и изучении механизма действия лекарственных и косметических средств, пестицидов, консервантов.

Методы культуры клеток нашли широкое применение для реконструкции различных тканей и органов. Так, культура клеток кожи используется для заместительной терапии при ожогах, культура клеток эндотелия — для реконструкции стенок сосудов. Способность клеток к росту в культуре привела к развитию методов клонирования, хранения и слияния клеток, что, в свою очередь, вызвало становление новой области науки — генетики соматических клеток. Органные культуры используют при изучении закономерностей развития органов, способов сохранения жизнеспособности изолированных органов, предназначенных для трансплантации.

Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, потребовалось овладеть рядом подходов и методик. В их числе методы получения клеток, свободных от экзогенных прокариот и грибов; разработки сред, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется; наблюдения за клетками в динамике их развития; непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.

Научную основу для разработки этих методик составляет представление о клетке как основном структурном элементе живых организмов животного и растительного происхождения. Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару. Он предположил, что не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. И если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. Такое понимание явления привело к необходимости разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма. В ходе проделанных работ был внесен ряд поправок в рецептуру среды культивирования, разработан дополнительный и очень существенный подход в технике работы с клетками, прежде всего, применение трипсина для высвобождения клеток из тканевой матрицы, в которой они находятся.

Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены Эрлом с сотрудниками в 1948 году. Игл (1955) систематически исследовал пищевые потребности клеток. До тех пор, пока в 1961 году Хейфлик и Мурхед не выделили линию диплоидных клеток человека (НДС) WI-38, считалось, что один раз установившаяся клеточная линия имеет неограниченное время жизни. Однако период ее существования в культуре ограничивался приблизительно 50 генерациями популяции, а при отмирании эти клетки оставались диплоидными и не имели признаков старения и злокачественных изменений. Клетки, выделенные из раковых опухолей или трансформированные в ходе культивирования, характеризуются «бессмертностью» и коррелируют с гетероплоидностью. И первые полученные суспензионные культуры клеток животных, как правило, основывались на клетках злокачественных тканей (клетки Hela).

Последующий этап в истории культивирования диплоидных клеток человека связан с установлением факта, что они являются генетически стабильными и свободными от всех известных латентных и онкогенных вирусов. Поэтому линии диплоидных клеток человека разрешено применять

для получения продуктов, предназначаемых для людей. Эта догма остается действующей и в настоящее время, хотя новейшие открытия отчетливо показали присутствие в клетках, выделенных из нормальных тканей, потенциальных онкогенов. Эти онкогены идентичны тем, которые найдены в известных онкогенных вирусах (вирусы саркомы). Позднее было установлено, что ряд вирусов способен индуцировать возникновение опухолей, и такие вирусы были названы онкогенными.

12.1. Характеристика клеток, культивируемых in vitro

Клетки одного и того же типа в ткани взаимодействуют друг с другом и согласовывают скорость деления, чтобы поддерживать надлежащую плотность популяции. Контроль такого рода четко проявляется при реакциях на повреждение. Например, когда поврежден эпителий, клетки по краям раны стимулируются к делению и наползанию на обнаженную поверхность до тех пор, пока она вновь не будет закрыта, после чего пролиферация и движение клеток прекращаются. Сходное явление можно наблюдать на диссоциированных клетках в культуре. Эпителиальные клетки или фибробласты, помещенные в чашку, в присутствии сыворотки будут «приклеиваться» к поверхности, распластываться и делиться до тех пор, пока не образуется сплошной монослой, в котором соседние клетки соприкасаются.

Нормальные клетки перестают делиться, и это явление известно, как торможение пролиферации, зависимое от плотности. Если такой монослой «поранить» иглой следующим образом, чтобы на чашке образовалась свободная от клеток полоска, клетки с краев этой полоски начинают продвигаться на свободное место и делиться.

Плотность клеточной популяции, при которой клетки в сплошном монослое перестают делиться, увеличивается с повышением концентрации факторов роста в среде. Кроме того, оказалось, что если культуральная жидкость будет протекать по поверхности чашки с островками

клеток, то клетки, омываемые средой, только что прошедшей над другими клетками, будут делиться медленнее, чем те, которые омываются средой, прошедшей над свободными от клеток участками. В среде, протекавшей над клетками, недостает каких-то важных питательных веществ или факторов роста.

Фактор роста обычно присутствует в среде в концентрации около 10 -10 М (примерно одна молекула в объеме сферы диаметром 3 мкм), и у каждой клетки достаточно рецепторов, чтобы связать все молекулы ростовых факторов. Конкуренция за факторы роста и питательные вещества не единственный фактор, влияющий на скорость деления в клеточной культуре. Форма клеток вовремя их распластывания и движения по поверхности субстрата на свободные места тоже сильно влияет на их способность делиться. При культивировании нормальных клеток в суспензии, когда они не прикреплены к твердой поверхности и поэтому имеют округлую форму, они почти никогда не делятся.

Влияние распластывания клеток на пролиферацию можно наблюдать при выращивании клеток на субстратах с различной адгезивностью поверхности или на таких субстратах, где имеются лишь крошечные адгезивные участки, на которых клетка может прикрепиться, но не может распластаться. При этом частота деления клеток возрастает с увеличением степени их распластывания. Возможно, что сильно распластанные клетки могут улавливать больше ростовых факторов и поглощать питательных веществ с увеличением своей поверхности.

Изменение ростовых свойств культивируемых клеток называется трансформацией. Трансформированные клетки способны расти в условиях, при которых отношение площади поверхности к объему менее благоприятны. Трансформированные клетки не имеют ограниченной продолжительности жизни, и это обусловливает такое их преимущество в биотехнологии, как использование в качестве субстрата.

Читайте также: Смешной овощ с грядки

В настоящее время практически любые клетки человека и животных могут быть введены (или уже введены) в культуру и тем самым служить средством и объектом во многих медико-биологических исследованиях. В их числе элементы соединительной ткани человека (фибробласты), скелетные ткани (кость и хрящи), сердечные и гладкие мышцы, эпителиальные ткани (печень, легкие, почки и др.), клетки нервной системы, эндокринные клетки, меланоциты и различные опухолевые клетки.

Наибольшее распространение получили культуры фибробластов. Это связано с легкостью их культивирования, а также с тем, что они составляют значительную часть массы тела и строму многих органов. Была доказана возможность экстраполяции данных, полученных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo (Гринберг, 1978). Основные доказательства заключаются в следующем. Во-первых, фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные клеткам в организме, а также онтогенетические и индивидуально генотипические свойства организма- донора. Во-вторых, не существует другого такого типа клеток, который в полной мере мог бы представлять свойства клеток организма. В-третьих, изменения, которые возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко контролировать и свести к минимуму при создании соответствующих условий.

Можно выделить два направления культивирования животных клеток: культуры клеток и культуры органов и тканей (органные культуры). Клетки в культурах размножаются, что обеспечивает получение большой массы клеток. Затем их идентифицируют, разделяют на идентичные параллели и, если необходимо, сохраняют. Поскольку динамические свойства культивируемых клеток бывает трудно контролировать и реконструировать in vitro некоторые клеточные взаимодействия, наблюдаемые in vivo, то отдано предпочтение использованию клеточных систем, сохраняющих структурную целостность исходной ткани.

Популяция клеток не всегда гомогенна и обладает фиксированным фенотипом. Некоторые культуры, например, клетки эпидермиса, содержат стволовые клетки, клетки-предшественники и чешуйчатые клетки. В такой культуре происходит постоянное обновление за счет стволовых клеток, пролиферация и созревание клеток-предшественников, а также необратимая дифференцировка, сопровождающаяся «слущиванием» чешуйчатых клеток в культуральную среду.

12.2. Культуральные системы животных клеток

Для введения в культуру лучше брать клетки, полученные из эмбриональных тканей. Они характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с соответствующими клетками зрелых тканей. Причиной этого служит низкий уровень специализации и наличие реплицирующихся клеток-предшественников в эмбрионах. Пролиферативная способность взрослых тканей ниже, они содержат больше неделящихся специализированных клеток.

Различают три основных типа культур животных клеток: первичные культуры, получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого пересева; диплоидныекультуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие диплоидный набор хромосом до 50 пересевов, которые затем трансформируются в постоянные(перевиваемые) гетероплоидные культуры, существующие вне организма десятки лет. Кроме того, культуры тканей могут подразделяться по виду животного, от которого они происходят; по типу ткани-источника; по состоянию ткани на момент извлечения (нормальные, опухолевые), по способу выращивания (монослойные, суспензионные, на микроносителях и т. п.). Главным фактором при выборе ткани или линии клеток для дальнейшего исследования является природа процесса, который будет изучаться на этих клетках.

12.2.1. Первичные культуры

Клетки, полученные от животного и поддерживаемые в культуре, называют первичными до тех пор, пока они не будут пассированы (субкультивированы), то есть до первого пересева. Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются низкой пролиферацией. В них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены. Однако первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro.Пассирование обеспечивает возможность продления существования культуры, возможность клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. При этом получаются более однородные популяции, а также теряются специализированные клетки.

Первичные культуры клеток получают путем стерильного удаления фрагмента ткани и его механической или ферментативной дезагрегации. В случае механической дезагрегации фрагмент ткани измельчают до кусочков размером около 1 мм, которые прикрепляются к субстрату благодаря собственной адгезивности, поверхности субстрата или сгустку плазмы. Ферментативная дезагрегация, использующая 0,01-0,25 % трипсина или 200-2000 ед./мл коллагеназы, дает более высокий выход клеток, хотя метод является селективным, поскольку не все клетки переживают диссоциацию. Главным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.

12.2.2. Постоянные культуры

После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшению размера клеток, снижению их адгезивности, округлению, увеличению ядерно-цитоплазматического соотношения), по увеличению скорости роста (время удвоения клеток снижается с 36-48 до 12-36 часов), по снижению зависимости от сыворотки и субстрата и, следовательно, их способности к росту в суспензии; по увеличению гетероплоидности (хромосомные различия между клетками), а также по увеличению опухолеродности. Однако нормальные клетки, спонтанно трансформируясь в постоянную линию, несмотря на некоторые черты сходства, не становятся при этом злокачественными. Таким образом, преимуществом постоянных клеточных линий являются высокая скорость роста, возможность достижения более высокой плотности, способность к суспензионному росту, а также возможность использования более дешевых сред. К числу недостатков относятся повышенная хромосомная нестабильность, отклонение от фенотипа донора и утрата специфических маркеров.

12.3. Питательные среды и условия культивирования

После извлечения клеток из ткани или организма используемая для выращивания культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это способствует выживанию клеток, их пролиферации и дифференцировке. Внеклеточная среда должна обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, то есть обладать всем необходимым для роста и выживания клеток.

Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотно-щелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство рН-среды является одним из главных условий культивирования.

Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Эти растворы, как и фосфатно-солевой буфер Дульбекко и Фогта, используются также для орошения и промывки клеток при пассировании культур, выделении клеточных линий и других манипуляциях с культурами клеток. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Оно определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 литр раствора (осмолярность). Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Для поддержания рН в большинстве сред используется бикарбонатный буфер. Растворы могут содержать малое количество бикарбонатного буфера (раствор Хенкса), они предназначены для поддержания рН в плотно закрытых сосудах. В других (растворе Эрла) бикарбоната больше, они используются в системах с повышенным парциальным давлением СО₂. Если культуры выращивают вне СО₂-инкубатора, где рН поддерживать труднее, используют альтернативные буферные системы. Хорошим буфером является HEPES 4-(2-оксиэтил)1- пиперазинэтансульфоновая кислота. HEPES легко растворим в воде, не связывает двухвалентные катионы, не цитотоксичен до концентрации 0,05 Моль.

Разработка питательных сред для культур животных клеток развивалась в двух направлениях — сред, содержащих природные добавки (сыворотки, эмбриональные экстракты и другие), и сред химически определенного состава. В настоящее время наиболее широко применяются среды, содержащие источники энергии (углеводы) и азота, незаменимые аминокислоты, витамины, неорганические соли (источники макро- и микроэлементов), нуклеозиды, жиры и жирорастворимые компоненты, гормоны, ростовые факторы, а также сыворотку (до 10 %) и некоторые другие добавки.

Сыворотка представляет собой смесь мелких и крупных молекул, которые могут как способствовать, так и тормозить рост клеток. К главным функциям сыворотки относятся обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост клеток и их функции; обеспечение факторами прикрепления и распластывания клеток; обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т. д. Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторы роста. Один и тот же тип клеток может быть стимулирован различными ростовыми факторами.

Для переноса низкомолекулярных факторов (витаминов, аминокислот, липидов и других) необходимы транспортные белки. В этой роли выступает альбумин. К факторам прикрепления и распластывания клеток относятся коллаген.

Культивирование клеток в присутствии сыворотки обнаруживает ряд недостатков. Это связано с тем, что для большинства клеток сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой они контактировали в исходной ткани. Кроме того, сыворотки могут содержать недостаточное количество специфических для данного вида клеток ростовых факторов, изменять биологические свойства в зависимости от серии, а в некоторых случаях проявлять цитотоксическое действие.

В последние годы разработаны бессывороточные среды, содержащие смесь гормонов и ростовых факторов. Бессывороточные среды имеют определенные преимущества. Они нетоксичны, обеспечивают лучшую воспроизводимость результатов опыта вследствие стабильности состава среды, снижают риск заражения культуры вирусами, грибами, микоплазмами. Такие среды снижают влияние сывороточных белков на результаты биологических исследований, их легче очистить от продуктов клеточного метаболизма. Однако бессывороточные среды имеет существенные недостатки. В частности, добавление в среду гормонов и факторов роста делает ее такой же дорогой, как среда с сывороткой. Кроме того, бессывороточные среды чаще пригодны для ограниченного числа клеток.

Из наиболее распространенных стандартных сред для культур животных клеток следует отметить среду Игла MEM (minimal essential medium) и BME (basal medium, Eagle). Чаще используется МЕМ, которая содержит минеральные вещества, аминокислоты, водорастворимые витамины, холин и инозит, выполняющие роль углеводного субстрата. МЕМ используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют биотин, витамин В₁₂, ионы железа и микроэлементы. Основа ее — раствор Эрла. Помимо перечисленных, используются среда Дульбекко, Искова, Мак Коя и 199 с сывороткой для быстро размножающихся клеток.

12.4. Системы культивирования клеток

Существует две основных системы культивирования клеток: проточные и непроточные культуры.

Непроточными называют системы культивирования, в которых клетки вводят в фиксированный объем среды. Такие системы пригодны для культивирования клеток как в монослое, так и в суспензии. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток. Для увеличения продолжительности жизни непроточных культур используют несколько способов: замена части культуры равным объемом свежей среды (прерывистый способ); увеличение объема культуры с постоянной низкой скоростью при периодическом удалении небольших порций клеток (постоянный способ); постоянное поступление в культуру свежей среды и одновременное удаление равного объема использованной бесклеточной среды (перфузионный способ). Причем перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, а среда возвращается в культуральный сосуд. Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.

Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Это единственная система, в которой все клетки гомогенны и сохраняют гомогенность в течение длительно периода. Гомеостаз обусловлен постоянным поступлением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

12.5. Монослойные и суспензионные культуры

В культивировании животных клеток существует два крупных направления: монослойные и суспензионные культуры.

12.5.1. Монослойные культуры

Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату: к другим клеткам, к стеклу, пластику или металлу. Клетки прикрепляются за счет электростатических взаимодействий, поэтому поверхность культуральных сосудов должна быть смачиваемой и отрицательно заряженной. Для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеидами, а также присутствие двухвалентных катионов кальция и магния.

Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Первичные клетки не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений. Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюдается также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии, но, если их не пересеять, они погибают. Из сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способностью снимать контактное торможение.

Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки, трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности. Трансформированные клетки способны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не наступает смена среды, то клетки быстро погибают. Монослойное культивирование осуществляют во флаконах (матрасах) или пробирках для культуры тканей, обеспечивающих поверхность роста 5-200 см 2 .

Монослойные культуры обладают рядом преимуществ:

— они создают возможность замены питательной среды и промывание клеток перед добавлением свежей питательной среды, что важно, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта — в других (например, при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду);

— позволяют обеспечить высокую плотность клеток с использованием перфузионной (перфузия — обливание) техники;

— обеспечивают тесные межклеточные контакты (что требуется, например, для распространения вирусов);

— обеспечивают более выраженную экспрессию целевого продукта, поскольку клетки прикреплены к субстрату;

— пригодны для любого типа клеток и позволяют использовать одну и ту же аппаратуру с разным отношением клетка-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.

Однако для монослойных культур характерны определенные недостатки:

— наличие большого пространства;

— увеличение стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;

— недостаточно эффективный контроль, обусловленный отбором проб;

— трудности с определением и поддержанием таких параметров, как pH и содержание О₂, и обеспечением гомогенности культуры клеток.

12.5.2. Суспензионные культуры

Для наращивания клеточной массы удобнее использовать не монослойные, а суспензионные культуры. Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют. Но если некоторые клетки культивировать во вращающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу, предотвращающую агрегацию клеток, то можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы. Иногда этого бывает достаточно для получения суспензионной культуры, но обычно требуются специальные сосуды для культивирования суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и магния.

Суспензионные культуры также можно получать путем обработки, отобранной для пересева монослойной клеточной культуры 0,02 % раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА. Суспензионные культуры лучше растут внутри ограниченного диапазона концентраций клеток и в том случае, когда сосуд наполнен средой наполовину.

Суспензионное культивирование первичных и перевиваемых клеточных линий проводят в роллерных установках (roll — вертеть, скручивать), где создаются благоприятные для клеток условия постоянного перемешивания жидкой и газовой фаз, общий объем среды при этом снижается вдвое по сравнению со стационарными условиями.

Суспензионное культивирование клеток также можно проводить в ферментерах, предназначенных для суспензионного культивирования микроорганизмов, в которых постоянное перемешивание клеток в среде осуществляется магнитными или механическими мешалками с высокой скоростью вращения, препятствующей прикреплению клеток к стенкам сосудов.

Суспензионное культивирование обеспечивает, по меньшей мере, 2-3-кратную экономию питательных сред, по сравнению с общепринятым стационарным монослойным культивированием при полном исключении дорогостоящих протеолитических ферментов и буферных растворов. Кроме того, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения получения больших количеств биомассы.

12.5.3. Монослойное культивирование на микроносителях

Сочетать положительные стороны монослойного и суспензионного культивирования позволяет использование системы с микроносителями. Микроносители — мелкие твердые частицы (поддерживаемые в суспензии благодаря перемешиванию), на поверхности которых клетки растут в виде монослоя. Микроносители должны быть нетоксичными, не сорбировать компоненты питательных сред и продукты метаболизма клеток, а также иметь поверхностный заряд или обменную емкость, достаточную для прикрепления клеток. Коммерческие микроносители имеют диаметр 100-200 мкм и подразделяются на декстрановые (в двух вариантах); микроносители, покрытые коллагеном или желатином; полистироловые микроносители; стеклянные и целлюлозные.

12.6. Клеточный цикл и цикл роста

После посева клеток во флакон они находятся в лаг-фазе продолжительностью 2-24 ч, сменяющейся фазой экспоненциального роста (логарифмическая фаза), в конце которой клетки достигают полного монослоя и входят в период замедленного роста или покоя (стационарная фаза). Затем следует фаза снижения количества и гибели клеток.

Растущие клетки делятся примерно один раз в каждые 24 часа. При отсутствии каких-либо ограничений клетки равномерно распределены по клеточному циклу, и если количество клеток удваивается через правильные промежутки времени, то говорят, что культура находится в стадии экспоненциального роста. Обычно после короткого периода экспоненциального роста тот или иной фактор становится лимитирующим. Это может происходить в результате истощения какого-либо фактора среды или в результате того, что культивируемые клетки полностью покроют поверхность, на которой растут.

В суспензии клетки могут поддерживать экспоненциальный рост в течение долгого периода и теоретически бесконечно, если их культивировать в хемостате, где увеличение поступления питательных веществ балансируется увеличением оттока клеточной суспензии. Это приводит к постоянству окружающих условий и числа клеток. На практике, однако, этого трудно достигнуть из-за бактериальной контаминации.

При необходимости получить синхронную популяцию, то есть популяцию клеток, находящихся в одной и той же фазе клеточного роста, используют два варианта методических приемов. В одном случае клетки блокируют с помощью химических или физических воздействий, чтобы они оставались на одной стадии клеточного цикла. Однако в результате таких воздействий клетки могут становиться по некоторым параметрам аномальными. В другом случае проводят селекцию клеток, находящихся на определенной стадии клеточного цикла. Отбор можно проводить на основании тех или иных физических свойств, например, слабого прикрепления клеток к субстрату или различного содержания ДНК в клетках, находящихся на разных стадиях клеточного цикла. Кроме того, отбирать клетки можно на основе химических свойств, вызывая избирательную гибель остающихся клеток.

При выполнении работ с клеточными культурами используют стеклянную и пластиковую посуду, средства для очистки воды, приборы для дозирования, разведения и пробоотбора, устройства для приготовления питательных сред, лабораторные термостаты, СО₂-инкубаторы, аэраторы, шейкеры, ферментеры и другое оборудование.

Биологическая библиотека — материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.

Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.

Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.

Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.

Источник