Способы выращивания клеток животных

Глубинное выращивание клеток в монослое. Направлено на получение наибольшей концентрации клеток в наименьшем объеме газовой фазы. При этом клетки животных размножаются, растут и развиваются в прикрепленном состоянии до тех пор, пока не сольются в монослой. Рост клеток в виде монослоя зависит от белков – фибронектинов (от лат. fibro – нить, nectere – связывать или соединять). Фибронектин – гликопротеин, обеспечивает межклеточную адгезию, прикрепление клеток к подложке, направляет их перемещение.

Прикрепление клеток зависит от следующих свойств субстрата: гидрофильность – адгезивные свойства более выражены для смачиваемых поверхностей; протяженность – поверхность субстрата должна быть больше нормальной длины клетки; горизонтальность – растущие клетки распространяются в направлении наименьшей кривизны субстрата. Например, если принять прикрепление клеток к агар-агару за единицу, то к полиэтилену они прикрепляются лучше в 8 раз, к резине – в 12 раз, к стеклу – в 16 раз, а к стали – в 20 раз.

В монослое выращивают клетки соединительной ткани (фибробласты), клетки почек кроликов, обезьян, собак, 10-14-дневных куриных эмбрионов. Выращивание проводят в строго асептических условиях при покачивании для омывания большей площади культуральной среды. Клетки попеременно погружают в жидкую и газообразную фазу, при этом с избытком обеспечивается потребность в кислороде.

Во время культивирования клеток учитываются следующие параметры: константные – качество материала, форма и объем культиватора; вариабельные – скорость покачивания, качество и объем среды, тип клеток и размер посевного материала, рН и температура среды, снабжение кислородом и содержание СО₂ в культиваторе, окислительно-восстановительный потенциал, концентрация основных источников питания.

Глубинное выращивание клеток в суспензированных культурах. При использовании микроносителей, суспендируемых в питательной среде, площадь выращиваемых клеток увеличивается. Клетки закрепляются на их поверхности, а затем разрастаются в виде монослоя. В таких системах совмещаются монослойные и суспензионные культуры клеток животных.

Применяют следующие микроносители: положительно заряженные ДЕАЕ-сефадексы (комбинация высокомолекулярного полимера декстрана с ионообменными смолами); сефадексы с коллагеновым покрытием (высокомолекулярный полимер декстрана); отрицательно заряженный полистирол; полые стеклянные сферы; микроносители из пористого шлачного стекла и др. После выращивания клетки отделяют от микроносителей центрифугированием; фильтрованием; обработкой трипсином с последующим промыванием и сепарированием.

Данный метод применяется для получения вирусных вакцин (против бешенства, полиомиелита, ящура).

Источник

Этапы культивирования клеток животных

1. Диссоциация тканей – при этом из организованных тканей получают одиночные клетки. Их затем используют для получения первичных культур, т.е. культур численно увеличивающихся клеток. В качестве источника первичных клеток используют: почки обезьян, собак, кроликов, куриных эмбрионов 14-дневного возраста; клетки легких эмбриона человека 12-16-недельного возраста и клетки почек такого эмбриона. Предпочтение отдается эмбриональным клеткам. При получении клеток от более старых доноров их урожай и качество снижаются, так как в их органах накапливается соединительная ткань.

Сначала ткань тонко измельчают с помощью гомогенизатора, путем продавливания ткани через сетку из нейлона или нержавеющей стали или нарезают скальпелем или ножницами. Содержимое разрушенных клеток захватывает интактные клетки, при этом образуются желатиноподобные агрегаты. Поэтому проводят дополнительную обработку этих агрегатов ДНК-азой.

Для предотвращения развития микробов-контаминантов растворы, которые используются при диссоциации ткани, должны содержать антибиотики широкого спектра действия (гентамицин, неомицин) или более специфичные антибиотики (фунгизон).

Для диссоциации тканей применяют гидролитические ферменты, которые разрушают внеклеточный матрикс: трипсин, проназу, коллагеназу, эластазу, диспазу, гиалуронидазу или смеси ферментов.

2. Сепарация клеток. При диссоциации получаются смешанные популяции эндотелиальных, фибробластных и эпителиальных клеток. Для получения какого-то определенного типа кровяных клеток используют следующие методы:

· Селективная обработка ферментами.Так, в присутствии коллагеназы увеличивается доля эпителиальных клеток.

· Специфические ингибиторы. Так, например, этилмеркуритиосалицилат натрия и йодоуксусная кислота более токсичны для фибробластов.

· Центрифугирование: изопикническое центрифугирование – в градиенте плотности; зональное или дифференциальное центрифугирование – по скорости седиментации, т.е. по размеру.

· Физические методы: электрофорез; дифференциальное прикрепление клеток к стеклу (например, эндотелиальные клетки прикрепляются к стеклу быстрее фибробластов, а фибробласты – быстрее эпителиальных клеток); разделение клеток между двумя водными фазами полимера (например, система декстран-полиэтиленгликоль, в которой полиэтиленгликоль сосредотачивается в верхней, а декстран в нижней фазах).

· Сортировка клеток – дляэтого используют автоматы по сортировке и учету потока клеток (цитомеры), с их помощью можно различать и сепарировать клеточные органеллы, например хромосомы в метафазе.

3. Субкультивирование и сбор урожая. Для снятия монослоя клеток с субстрата применяются те же ферменты, что и для диссоциации тканей, чаще – трипсин. Перед добавлением трипсина клеточный пласт промывают фосфатно-солевым буферным раствором для удаления остаточных следов сыворотки.

Если жизнеспособные клетки не требуются (например, при сборе клеток для извлечения антигенов), то их собирают следующими способами: встряхивание со стеклянными бусами; соскабливание пласта шпателем или стержнем с резиновым покрытием; применение ультразвука; применение детергентных препаратов; замораживание и оттаивание.

4. Подсчет общего числа клеток. Для этого используют гемоцитомеры; электронный метод; прямой метод – определение массы клеток по содержанию в них белков, белкового азота или по сухому веществу при условии, если взятые клетки были полностью отмыты от сыворотки и других компонентов среды; косвенный метод – по изменению метаболических процессов; радиохимические методы.

5. Синхронизация роста. Для многих исследований требуются клетки в одной и той же фазе развития. Для получения таких клеток используют два метода:

· Блокирование (индукция) – при этом клетки блокируются в фиксированной точке жизненного цикла и накапливаются в данной фазе. Затем клетки высвобождают из образовавшегося блока (обычно промыванием) и далее обеспечивают их синхронное развитие. Для блокирования клеток применяют ингибиторы митоза (колцемид, винбластин); ингибиторы синтеза ДНК (тимидин, аметоптерин, 5-аминоурацил и гидроксимочевина). Частично синхронизируют клетки воздействием холодом, голоданием. Синхронизация обычно охватывает 20 — 50 % клеток. Увеличение достигается повтором блокирований.

· Селекция (сепарация) – при этом клетки извлекают из популяции физическими методами: митотическое «стряхивание» – основано на том, что во время митоза клетки монослоя округляются и слабее прикрепляются к субстрату и друг к другу; скоростное центрифугирование – при этом отселекционируют фракцию клеток одинакового объема и возраста. При этом синхронизируется 60-75% клеток.

6. Иммобилизация и микрокапсулирование клеток.Основная задача – стабилизация клеток и создание для них оптимальных условий. Клетки могут быть иммобилизованы адсорбцией; ковалентным связыванием; перекрестным связыванием; заключением в полимерные матриксы. Для этого используют желатин, полилизин, альгинат, агарозу. Такая техника обеспечивает защиту клеток при перевозке; длительное хранение клеток при 4ºС; исключение иммунного отторжения трансплантированных клеток; защиту хрупких клеток (например, гибридом) от механических воздействий. При культивировании инкапсулированных клеток легче производить смену среды в ферментере; регулировать соотношение объемов клеток и питательной среды; выделять продукты, свободные от клеток.

7. Консервирование клеток животных. Консервирование позволяет сохранить нужный геном в биотехнологии; сохранить посевной материал высокого качества; длительно сохранить запас клеток, имеющих ограниченную продолжительность жизни и не выдерживающих большое число пассажей; обеспечить генетические исследования запасом родительских клеток; сохранить резервный фонд клеток на случай утраты основного фонда; не подвергать клетки субкультивированию до того времени, пока это непосредственно не потребуется; сберечь затраты труда, питательные среды, а также уменьшить риск контаминации; проводить эксперименты по слиянию клонов без спешки.

Клетки животных не переносят лиофильной сушки (сублимация). Практически утрачивают жизнеспособность при температуре ниже -25ºС. Некоторые клетки выживают при -70ºС и даже при -140ºС. Наиболее распространенно хранение клеток в жидком азоте (температура – -196ºС). При этом клетки полностью стабильны.

В зависимости от скорости замораживания происходят последовательно или одновременно три явления образование кристаллов льда; удаление воды; повышение концентрации растворенных веществ. Повреждение клеток и утрату ими жизнеспособности могут вызвать образование внутриклеточного льда – это происходит при скорости охлаждения выше 100ºС/мин; высокая концентрация солей при пониженных скоростях охлаждения – менее 1ºС/мин.

Чтобы избежать значительных градиентов температуры в замораживаемой смеси, применяют как можно меньшие объемы замораживаемого материала. Обычно это стеклянные ампулы емкостью 1 мл. Если объем замораживаемого материала слишком большой, то используют пластиковые мешки, применяемые для хранения крови. При этом замораживаемый материал распределяется тонким слоем по большой поверхности. Это обеспечивает лучшие условия для теплообмена.

8. Восстановление жизненных функций. При оттаивании культуры её следует разогреть со скоростью не менее 400°С/мин. Когда клетки оттают, ампулу открывают и ее содержимое вносят в среду для выращивания с температурой 37°С.

Источник

РОСТ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИООБЪЕКТОВ — В. М. Самыгин — 2016

ГЛАВА 12. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

Возможность сохранения живых тканей вне организма в 1885 году показал У. Ру (W. Roux), который сохранял в жизнеспособном состоянии оболочку куриного эмбриона в теплом физиологическом растворе. Позднее, в 1897 году, Леб (Loeb) поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови. Льюнгрен (1898) показал возможность поддержания эксплантатов кожи человека в жизнеспособном состоянии в кислой среде с сохранением способности к реимплантации. В 1913 году А.Каррель применил плазму крови, обогащенную экстрактом эмбриона. Этот процесс был продолжен на протяжении длительного времени и назван как культивирование «бессмертных» клеток. Таким образом, признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, датируется первым десятилетием XX века.

После того как стало известно, что подобные процессы реальны, была продемонстрирована возможность выращивания и репродукции в таких клетках фильтрующихся инфекционных агентов — вирусов и получение в больших количеств вирусного материала для применения в вакцинных препаратах. Появилась возможность встраивать в клетки специфические экзогенно полученные гены и получать их экспрессию, а также выращивать в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции стали получать из клетки, выделявшей in vitro антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости оказались одинаковыми.

Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение в различных областях исследований — от клеточной и молекулярной биологии до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии. Культуру животных тканей применяют для изучения механизмов роста и дифференцировки клеток, межтканевых и межклеточных взаимодействий, обмена веществ и т. п. Культуры животных клеток являются важными продуцентами многих биологически важных веществ. На них выращивают вирусы для их идентификации и получения вакцин. Клеточные культуры часто применяют при тестировании и изучении механизма действия лекарственных и косметических средств, пестицидов, консервантов.

Методы культуры клеток нашли широкое применение для реконструкции различных тканей и органов. Так, культура клеток кожи используется для заместительной терапии при ожогах, культура клеток эндотелия — для реконструкции стенок сосудов. Способность клеток к росту в культуре привела к развитию методов клонирования, хранения и слияния клеток, что, в свою очередь, вызвало становление новой области науки — генетики соматических клеток. Органные культуры используют при изучении закономерностей развития органов, способов сохранения жизнеспособности изолированных органов, предназначенных для трансплантации.

Чтобы показать способность клеток животных расти и делиться в культуре, потребовалось овладеть рядом подходов и методик. В их числе методы получения клеток, свободных от экзогенных прокариот и грибов; разработки сред, в которых рост «вырезанных из ткани» или изолированных клеток не подавляется; наблюдения за клетками в динамике их развития; непрерывного культивирования культур клеток животных in vitro и поддержания их свободными от других биологических агентов.

Научную основу для разработки этих методик составляет представление о клетке как основном структурном элементе живых организмов животного и растительного происхождения. Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro возникла на базе концепции, принадлежащей Клоду Бернару. Он предположил, что не только живые организмы способны сохранять постоянство внутренних условий вне зависимости от изменений в окружающей среде. Клетка вне организма животного тоже будет стремиться поддерживать свои внутренние условия. И если различия между внутренними и внешними условиями будут незначительными, то высока вероятность роста и деления клетки. Такое понимание явления привело к необходимости разработки сред, способных поддерживать и стимулировать рост клеток вне организма. В ходе проделанных работ был внесен ряд поправок в рецептуру среды культивирования, разработан дополнительный и очень существенный подход в технике работы с клетками, прежде всего, применение трипсина для высвобождения клеток из тканевой матрицы, в которой они находятся.

Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены Эрлом с сотрудниками в 1948 году. Игл (1955) систематически исследовал пищевые потребности клеток. До тех пор, пока в 1961 году Хейфлик и Мурхед не выделили линию диплоидных клеток человека (НДС) WI-38, считалось, что один раз установившаяся клеточная линия имеет неограниченное время жизни. Однако период ее существования в культуре ограничивался приблизительно 50 генерациями популяции, а при отмирании эти клетки оставались диплоидными и не имели признаков старения и злокачественных изменений. Клетки, выделенные из раковых опухолей или трансформированные в ходе культивирования, характеризуются «бессмертностью» и коррелируют с гетероплоидностью. И первые полученные суспензионные культуры клеток животных, как правило, основывались на клетках злокачественных тканей (клетки Hela).

Последующий этап в истории культивирования диплоидных клеток человека связан с установлением факта, что они являются генетически стабильными и свободными от всех известных латентных и онкогенных вирусов. Поэтому линии диплоидных клеток человека разрешено применять

для получения продуктов, предназначаемых для людей. Эта догма остается действующей и в настоящее время, хотя новейшие открытия отчетливо показали присутствие в клетках, выделенных из нормальных тканей, потенциальных онкогенов. Эти онкогены идентичны тем, которые найдены в известных онкогенных вирусах (вирусы саркомы). Позднее было установлено, что ряд вирусов способен индуцировать возникновение опухолей, и такие вирусы были названы онкогенными.

12.1. Характеристика клеток, культивируемых in vitro

Клетки одного и того же типа в ткани взаимодействуют друг с другом и согласовывают скорость деления, чтобы поддерживать надлежащую плотность популяции. Контроль такого рода четко проявляется при реакциях на повреждение. Например, когда поврежден эпителий, клетки по краям раны стимулируются к делению и наползанию на обнаженную поверхность до тех пор, пока она вновь не будет закрыта, после чего пролиферация и движение клеток прекращаются. Сходное явление можно наблюдать на диссоциированных клетках в культуре. Эпителиальные клетки или фибробласты, помещенные в чашку, в присутствии сыворотки будут «приклеиваться» к поверхности, распластываться и делиться до тех пор, пока не образуется сплошной монослой, в котором соседние клетки соприкасаются.

Нормальные клетки перестают делиться, и это явление известно, как торможение пролиферации, зависимое от плотности. Если такой монослой «поранить» иглой следующим образом, чтобы на чашке образовалась свободная от клеток полоска, клетки с краев этой полоски начинают продвигаться на свободное место и делиться.

Плотность клеточной популяции, при которой клетки в сплошном монослое перестают делиться, увеличивается с повышением концентрации факторов роста в среде. Кроме того, оказалось, что если культуральная жидкость будет протекать по поверхности чашки с островками

клеток, то клетки, омываемые средой, только что прошедшей над другими клетками, будут делиться медленнее, чем те, которые омываются средой, прошедшей над свободными от клеток участками. В среде, протекавшей над клетками, недостает каких-то важных питательных веществ или факторов роста.

Фактор роста обычно присутствует в среде в концентрации около 10 -10 М (примерно одна молекула в объеме сферы диаметром 3 мкм), и у каждой клетки достаточно рецепторов, чтобы связать все молекулы ростовых факторов. Конкуренция за факторы роста и питательные вещества не единственный фактор, влияющий на скорость деления в клеточной культуре. Форма клеток вовремя их распластывания и движения по поверхности субстрата на свободные места тоже сильно влияет на их способность делиться. При культивировании нормальных клеток в суспензии, когда они не прикреплены к твердой поверхности и поэтому имеют округлую форму, они почти никогда не делятся.

Влияние распластывания клеток на пролиферацию можно наблюдать при выращивании клеток на субстратах с различной адгезивностью поверхности или на таких субстратах, где имеются лишь крошечные адгезивные участки, на которых клетка может прикрепиться, но не может распластаться. При этом частота деления клеток возрастает с увеличением степени их распластывания. Возможно, что сильно распластанные клетки могут улавливать больше ростовых факторов и поглощать питательных веществ с увеличением своей поверхности.

Изменение ростовых свойств культивируемых клеток называется трансформацией. Трансформированные клетки способны расти в условиях, при которых отношение площади поверхности к объему менее благоприятны. Трансформированные клетки не имеют ограниченной продолжительности жизни, и это обусловливает такое их преимущество в биотехнологии, как использование в качестве субстрата.

В настоящее время практически любые клетки человека и животных могут быть введены (или уже введены) в культуру и тем самым служить средством и объектом во многих медико-биологических исследованиях. В их числе элементы соединительной ткани человека (фибробласты), скелетные ткани (кость и хрящи), сердечные и гладкие мышцы, эпителиальные ткани (печень, легкие, почки и др.), клетки нервной системы, эндокринные клетки, меланоциты и различные опухолевые клетки.

Наибольшее распространение получили культуры фибробластов. Это связано с легкостью их культивирования, а также с тем, что они составляют значительную часть массы тела и строму многих органов. Была доказана возможность экстраполяции данных, полученных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo (Гринберг, 1978). Основные доказательства заключаются в следующем. Во-первых, фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные клеткам в организме, а также онтогенетические и индивидуально генотипические свойства организма- донора. Во-вторых, не существует другого такого типа клеток, который в полной мере мог бы представлять свойства клеток организма. В-третьих, изменения, которые возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко контролировать и свести к минимуму при создании соответствующих условий.

Можно выделить два направления культивирования животных клеток: культуры клеток и культуры органов и тканей (органные культуры). Клетки в культурах размножаются, что обеспечивает получение большой массы клеток. Затем их идентифицируют, разделяют на идентичные параллели и, если необходимо, сохраняют. Поскольку динамические свойства культивируемых клеток бывает трудно контролировать и реконструировать in vitro некоторые клеточные взаимодействия, наблюдаемые in vivo, то отдано предпочтение использованию клеточных систем, сохраняющих структурную целостность исходной ткани.

Популяция клеток не всегда гомогенна и обладает фиксированным фенотипом. Некоторые культуры, например, клетки эпидермиса, содержат стволовые клетки, клетки-предшественники и чешуйчатые клетки. В такой культуре происходит постоянное обновление за счет стволовых клеток, пролиферация и созревание клеток-предшественников, а также необратимая дифференцировка, сопровождающаяся «слущиванием» чешуйчатых клеток в культуральную среду.

12.2. Культуральные системы животных клеток

Для введения в культуру лучше брать клетки, полученные из эмбриональных тканей. Они характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с соответствующими клетками зрелых тканей. Причиной этого служит низкий уровень специализации и наличие реплицирующихся клеток-предшественников в эмбрионах. Пролиферативная способность взрослых тканей ниже, они содержат больше неделящихся специализированных клеток.

Различают три основных типа культур животных клеток: первичные культуры, получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого пересева; диплоидныекультуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие диплоидный набор хромосом до 50 пересевов, которые затем трансформируются в постоянные(перевиваемые) гетероплоидные культуры, существующие вне организма десятки лет. Кроме того, культуры тканей могут подразделяться по виду животного, от которого они происходят; по типу ткани-источника; по состоянию ткани на момент извлечения (нормальные, опухолевые), по способу выращивания (монослойные, суспензионные, на микроносителях и т. п.). Главным фактором при выборе ткани или линии клеток для дальнейшего исследования является природа процесса, который будет изучаться на этих клетках.

12.2.1. Первичные культуры

Клетки, полученные от животного и поддерживаемые в культуре, называют первичными до тех пор, пока они не будут пассированы (субкультивированы), то есть до первого пересева. Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются низкой пролиферацией. В них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены. Однако первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro.Пассирование обеспечивает возможность продления существования культуры, возможность клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. При этом получаются более однородные популяции, а также теряются специализированные клетки.

Первичные культуры клеток получают путем стерильного удаления фрагмента ткани и его механической или ферментативной дезагрегации. В случае механической дезагрегации фрагмент ткани измельчают до кусочков размером около 1 мм, которые прикрепляются к субстрату благодаря собственной адгезивности, поверхности субстрата или сгустку плазмы. Ферментативная дезагрегация, использующая 0,01-0,25 % трипсина или 200-2000 ед./мл коллагеназы, дает более высокий выход клеток, хотя метод является селективным, поскольку не все клетки переживают диссоциацию. Главным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.

12.2.2. Постоянные культуры

После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшению размера клеток, снижению их адгезивности, округлению, увеличению ядерно-цитоплазматического соотношения), по увеличению скорости роста (время удвоения клеток снижается с 36-48 до 12-36 часов), по снижению зависимости от сыворотки и субстрата и, следовательно, их способности к росту в суспензии; по увеличению гетероплоидности (хромосомные различия между клетками), а также по увеличению опухолеродности. Однако нормальные клетки, спонтанно трансформируясь в постоянную линию, несмотря на некоторые черты сходства, не становятся при этом злокачественными. Таким образом, преимуществом постоянных клеточных линий являются высокая скорость роста, возможность достижения более высокой плотности, способность к суспензионному росту, а также возможность использования более дешевых сред. К числу недостатков относятся повышенная хромосомная нестабильность, отклонение от фенотипа донора и утрата специфических маркеров.

12.3. Питательные среды и условия культивирования

После извлечения клеток из ткани или организма используемая для выращивания культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это способствует выживанию клеток, их пролиферации и дифференцировке. Внеклеточная среда должна обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, то есть обладать всем необходимым для роста и выживания клеток.

Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотно-щелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство рН-среды является одним из главных условий культивирования.

Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Эти растворы, как и фосфатно-солевой буфер Дульбекко и Фогта, используются также для орошения и промывки клеток при пассировании культур, выделении клеточных линий и других манипуляциях с культурами клеток. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Оно определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 литр раствора (осмолярность). Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Для поддержания рН в большинстве сред используется бикарбонатный буфер. Растворы могут содержать малое количество бикарбонатного буфера (раствор Хенкса), они предназначены для поддержания рН в плотно закрытых сосудах. В других (растворе Эрла) бикарбоната больше, они используются в системах с повышенным парциальным давлением СО₂. Если культуры выращивают вне СО₂-инкубатора, где рН поддерживать труднее, используют альтернативные буферные системы. Хорошим буфером является HEPES 4-(2-оксиэтил)1- пиперазинэтансульфоновая кислота. HEPES легко растворим в воде, не связывает двухвалентные катионы, не цитотоксичен до концентрации 0,05 Моль.

Разработка питательных сред для культур животных клеток развивалась в двух направлениях — сред, содержащих природные добавки (сыворотки, эмбриональные экстракты и другие), и сред химически определенного состава. В настоящее время наиболее широко применяются среды, содержащие источники энергии (углеводы) и азота, незаменимые аминокислоты, витамины, неорганические соли (источники макро- и микроэлементов), нуклеозиды, жиры и жирорастворимые компоненты, гормоны, ростовые факторы, а также сыворотку (до 10 %) и некоторые другие добавки.

Сыворотка представляет собой смесь мелких и крупных молекул, которые могут как способствовать, так и тормозить рост клеток. К главным функциям сыворотки относятся обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост клеток и их функции; обеспечение факторами прикрепления и распластывания клеток; обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т. д. Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторы роста. Один и тот же тип клеток может быть стимулирован различными ростовыми факторами.

Для переноса низкомолекулярных факторов (витаминов, аминокислот, липидов и других) необходимы транспортные белки. В этой роли выступает альбумин. К факторам прикрепления и распластывания клеток относятся коллаген.

Культивирование клеток в присутствии сыворотки обнаруживает ряд недостатков. Это связано с тем, что для большинства клеток сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой они контактировали в исходной ткани. Кроме того, сыворотки могут содержать недостаточное количество специфических для данного вида клеток ростовых факторов, изменять биологические свойства в зависимости от серии, а в некоторых случаях проявлять цитотоксическое действие.

В последние годы разработаны бессывороточные среды, содержащие смесь гормонов и ростовых факторов. Бессывороточные среды имеют определенные преимущества. Они нетоксичны, обеспечивают лучшую воспроизводимость результатов опыта вследствие стабильности состава среды, снижают риск заражения культуры вирусами, грибами, микоплазмами. Такие среды снижают влияние сывороточных белков на результаты биологических исследований, их легче очистить от продуктов клеточного метаболизма. Однако бессывороточные среды имеет существенные недостатки. В частности, добавление в среду гормонов и факторов роста делает ее такой же дорогой, как среда с сывороткой. Кроме того, бессывороточные среды чаще пригодны для ограниченного числа клеток.

Из наиболее распространенных стандартных сред для культур животных клеток следует отметить среду Игла MEM (minimal essential medium) и BME (basal medium, Eagle). Чаще используется МЕМ, которая содержит минеральные вещества, аминокислоты, водорастворимые витамины, холин и инозит, выполняющие роль углеводного субстрата. МЕМ используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют биотин, витамин В₁₂, ионы железа и микроэлементы. Основа ее — раствор Эрла. Помимо перечисленных, используются среда Дульбекко, Искова, Мак Коя и 199 с сывороткой для быстро размножающихся клеток.

12.4. Системы культивирования клеток

Существует две основных системы культивирования клеток: проточные и непроточные культуры.

Непроточными называют системы культивирования, в которых клетки вводят в фиксированный объем среды. Такие системы пригодны для культивирования клеток как в монослое, так и в суспензии. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток. Для увеличения продолжительности жизни непроточных культур используют несколько способов: замена части культуры равным объемом свежей среды (прерывистый способ); увеличение объема культуры с постоянной низкой скоростью при периодическом удалении небольших порций клеток (постоянный способ); постоянное поступление в культуру свежей среды и одновременное удаление равного объема использованной бесклеточной среды (перфузионный способ). Причем перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, а среда возвращается в культуральный сосуд. Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.

Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Это единственная система, в которой все клетки гомогенны и сохраняют гомогенность в течение длительно периода. Гомеостаз обусловлен постоянным поступлением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

12.5. Монослойные и суспензионные культуры

В культивировании животных клеток существует два крупных направления: монослойные и суспензионные культуры.

12.5.1. Монослойные культуры

Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату: к другим клеткам, к стеклу, пластику или металлу. Клетки прикрепляются за счет электростатических взаимодействий, поэтому поверхность культуральных сосудов должна быть смачиваемой и отрицательно заряженной. Для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеидами, а также присутствие двухвалентных катионов кальция и магния.

Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Первичные клетки не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений. Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюдается также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии, но, если их не пересеять, они погибают. Из сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способностью снимать контактное торможение.

Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки, трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности. Трансформированные клетки способны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не наступает смена среды, то клетки быстро погибают. Монослойное культивирование осуществляют во флаконах (матрасах) или пробирках для культуры тканей, обеспечивающих поверхность роста 5-200 см 2 .

Монослойные культуры обладают рядом преимуществ:

— они создают возможность замены питательной среды и промывание клеток перед добавлением свежей питательной среды, что важно, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта — в других (например, при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду);

— позволяют обеспечить высокую плотность клеток с использованием перфузионной (перфузия — обливание) техники;

— обеспечивают тесные межклеточные контакты (что требуется, например, для распространения вирусов);

— обеспечивают более выраженную экспрессию целевого продукта, поскольку клетки прикреплены к субстрату;

— пригодны для любого типа клеток и позволяют использовать одну и ту же аппаратуру с разным отношением клетка-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.

Однако для монослойных культур характерны определенные недостатки:

— наличие большого пространства;

— увеличение стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;

— недостаточно эффективный контроль, обусловленный отбором проб;

— трудности с определением и поддержанием таких параметров, как pH и содержание О₂, и обеспечением гомогенности культуры клеток.

12.5.2. Суспензионные культуры

Для наращивания клеточной массы удобнее использовать не монослойные, а суспензионные культуры. Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют. Но если некоторые клетки культивировать во вращающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу, предотвращающую агрегацию клеток, то можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы. Иногда этого бывает достаточно для получения суспензионной культуры, но обычно требуются специальные сосуды для культивирования суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и магния.

Суспензионные культуры также можно получать путем обработки, отобранной для пересева монослойной клеточной культуры 0,02 % раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА. Суспензионные культуры лучше растут внутри ограниченного диапазона концентраций клеток и в том случае, когда сосуд наполнен средой наполовину.

Суспензионное культивирование первичных и перевиваемых клеточных линий проводят в роллерных установках (roll — вертеть, скручивать), где создаются благоприятные для клеток условия постоянного перемешивания жидкой и газовой фаз, общий объем среды при этом снижается вдвое по сравнению со стационарными условиями.

Суспензионное культивирование клеток также можно проводить в ферментерах, предназначенных для суспензионного культивирования микроорганизмов, в которых постоянное перемешивание клеток в среде осуществляется магнитными или механическими мешалками с высокой скоростью вращения, препятствующей прикреплению клеток к стенкам сосудов.

Суспензионное культивирование обеспечивает, по меньшей мере, 2-3-кратную экономию питательных сред, по сравнению с общепринятым стационарным монослойным культивированием при полном исключении дорогостоящих протеолитических ферментов и буферных растворов. Кроме того, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения получения больших количеств биомассы.

12.5.3. Монослойное культивирование на микроносителях

Сочетать положительные стороны монослойного и суспензионного культивирования позволяет использование системы с микроносителями. Микроносители — мелкие твердые частицы (поддерживаемые в суспензии благодаря перемешиванию), на поверхности которых клетки растут в виде монослоя. Микроносители должны быть нетоксичными, не сорбировать компоненты питательных сред и продукты метаболизма клеток, а также иметь поверхностный заряд или обменную емкость, достаточную для прикрепления клеток. Коммерческие микроносители имеют диаметр 100-200 мкм и подразделяются на декстрановые (в двух вариантах); микроносители, покрытые коллагеном или желатином; полистироловые микроносители; стеклянные и целлюлозные.

12.6. Клеточный цикл и цикл роста

После посева клеток во флакон они находятся в лаг-фазе продолжительностью 2-24 ч, сменяющейся фазой экспоненциального роста (логарифмическая фаза), в конце которой клетки достигают полного монослоя и входят в период замедленного роста или покоя (стационарная фаза). Затем следует фаза снижения количества и гибели клеток.

Растущие клетки делятся примерно один раз в каждые 24 часа. При отсутствии каких-либо ограничений клетки равномерно распределены по клеточному циклу, и если количество клеток удваивается через правильные промежутки времени, то говорят, что культура находится в стадии экспоненциального роста. Обычно после короткого периода экспоненциального роста тот или иной фактор становится лимитирующим. Это может происходить в результате истощения какого-либо фактора среды или в результате того, что культивируемые клетки полностью покроют поверхность, на которой растут.

В суспензии клетки могут поддерживать экспоненциальный рост в течение долгого периода и теоретически бесконечно, если их культивировать в хемостате, где увеличение поступления питательных веществ балансируется увеличением оттока клеточной суспензии. Это приводит к постоянству окружающих условий и числа клеток. На практике, однако, этого трудно достигнуть из-за бактериальной контаминации.

При необходимости получить синхронную популяцию, то есть популяцию клеток, находящихся в одной и той же фазе клеточного роста, используют два варианта методических приемов. В одном случае клетки блокируют с помощью химических или физических воздействий, чтобы они оставались на одной стадии клеточного цикла. Однако в результате таких воздействий клетки могут становиться по некоторым параметрам аномальными. В другом случае проводят селекцию клеток, находящихся на определенной стадии клеточного цикла. Отбор можно проводить на основании тех или иных физических свойств, например, слабого прикрепления клеток к субстрату или различного содержания ДНК в клетках, находящихся на разных стадиях клеточного цикла. Кроме того, отбирать клетки можно на основе химических свойств, вызывая избирательную гибель остающихся клеток.

При выполнении работ с клеточными культурами используют стеклянную и пластиковую посуду, средства для очистки воды, приборы для дозирования, разведения и пробоотбора, устройства для приготовления питательных сред, лабораторные термостаты, СО₂-инкубаторы, аэраторы, шейкеры, ферментеры и другое оборудование.

Биологическая библиотека — материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.

Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.

Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.

Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.

Источник