Меню

Среда для выращивания хламидий

Диагностика хламидиоза.
Изучение хламидий на культуре клеток McCoy

Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким является метод диагностики хламидий путем изоляции возбудителя на культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами (“золотой стандарт”). Для этой цели обычно используют чувствительную культуру клеток, обработанную циклогексимидом. Чувствительность культурального метода по сравнению с ПЦР составляет 70-80%, но в то же время он превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по специфичности. В литературе описаны случаи выявления хламидии трахоматис методом ПЦР при отрицательных результатах культурального теста и наоборот.

Показания:

  • Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.
  • Оценка эффективности проведенного антибактериального лечения.
  • Выявление чувствительности и резистентности к антибактериальным препаратам.
  • Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со вторичными иммунодефицитными состояниями (онкологические больные после проведенных курсов лучевой и химиотерапии, трансплантации костного мозга; лица, получающие иммунодепрессанты; больные вирусным гепатитом и туберкулезом).
  • Бесплодие неясного генеза.
  • Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.

Культуральный посев является референс-методом при оценке эффективности антибактериального лечения. При исследовании биопроб методом ПЦР после курса химиотерапии в некоторых случаях можно получить “ложноположительные с клинической точки зрения” результаты. Это связано с тем, что невозможно однозначно оценить жизнеспособность и патогенность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только данные молекулярно-биологических методов . В этом случае при исследовании клинического материала с помощью культурального посева микробные клетки, потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, не дадут роста в клеточной культуре.

Методика:

Для транспортировки и хранения клинического материала используют специальную питательную среду (транспортная среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и хранится при температуре + 4 0 C (в общей камере бытового холодильника) в течение 2-х месяцев. Состав транспортной среды: среда МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотика гентамицина концентрации 50 мкг/мл .

Клинический материал после перенесения в транспортную среду хранится в общей камере холодильника при температуре + 4 0 С и, в течение двух суток должен быть доставлен в лабораторию.

Процедура посева

  1. Обработка однодневной клеточной культуры McCoy 1% раствором ДЕАЕ декстраном в течение 30 минут.
  2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от больных.
  3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение 45 минут.
  4. Отмывка клеток питательной средой.
  5. Добавление к клеткам ростовой среды, cодержащей циклогексимид.
  6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 0 C.
  7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой иммунофлюоресценции или ПЦР.

Реальный срок получения результатов этим методом — семь дней.

Определение чувствительности:

В настоящее время в литературе растет число сообщений о случаях резистентности хламидий к антибактериальным препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, фторхинолонам). Ценность культурального метода состоит в том, что он является пока единственным методом, позволяющим выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии.

Схема метода выявления устойчивости Chlamydia trachomatis к антибактериальным препаратам

  • Хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве заражают чувствительные клетки.
  • К зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую антибиотик.
  • Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36 0 C.

Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по подавлению инфекции в зараженных клетках. Процедура длительная, занимает по времени две недели.

УВЕДОМЛЕНИЕ

Данная работа написана врачами-профессионалами для врачей-профессионалов.
Она не предназначена для широкой аудитории и не является руководством
для диагностики и тем более лечения каких-либо заболеваний без участия врача.

Источник

Особенности культивирования риккетсий и хламидий.

Риккетсии и хламидии – бактерии, которые, как и вирусы, являются облигатными внутриклеточными паразитами. Поэтому для их культивирования применяются: а) тканевые культуры (описаны выше); б) куриные эмбрионы; в) лабораторные животные.

Культивирование риккетсий проводят на переживающих тканях в жидкой среде Мейтлендов (раствор Тироде и сыворотка) при 37 С 10-14 дней или на Тироде-сывороточном агаре с добавлением на поверхность измельченной эпителиальной ткани при 37 С 6-10 дней.

Широко используется культивирование в 8-12-дневном курином эмбрионе. Эмбрион заражают в полость желточного мешка или на хорион-аллантоисную оболочку. Зараженные яйца помещают в термостат при 37 С на 6-7 дней. Этот метод используется при изготовлении вакцин и диагностических препаратов из риккетсий.

Риккетсии культивируют в организме белых мышей, которых заражают интраназально. В легких мышей накапливается большое количество риккетсий.

Риккетсии выращивают по методу Вейгля и Мосинга. Для этого платяных вшей заражают взвесью риккетсий путем введения в кишку через анальное отверстие с помощью специальных капилляров. Пшеничнов и Райхер разработали метод культивирования риккетсий на личинках вшей, которых кормят дефибринированной кровью с риккетсиями через мембрану кожи трупа.

Лекция № 7 Микрофлора почвы, воды, воздуха. Санитарно-показательные микроорганизмы. Методы санитарно-бактериологических исследований почвы, воды, воздуха.

Микроорганизмы широко распространены в природе: в воздухе, воде, почве, на предметах, в организме растений, животных и человека.

Из организма человека и животных в окружающую среду (в почву, воду, воздух и др.) попадают условно-патогенные и патогенные микроорганизмы. Попадают, в основном, 2-мя путями: 1) фекальный (с испражнениями из кишечника); 2) воздушно-капельный (с капельками слизи из дыхательных путей).

Загрязнение окружающей среды патогенными микроорганизмами делает ее фактором передачи инфекционных заболеваний.

Для определения в окружающей среде микроорганизмов, которые отрицательно влияют на здоровье человека, проводится санитарно-бактериологическое исследование почвы, воды, воздуха.

Методы исследования разрабатывает санитарная микробиология.

Определение в объектах среды патогенных микроорганизмов затруднительно, т.к. они находятся в среде временно, в небольшом количестве, а методы их определения длительные и трудоемкие.

Поэтому для оценки санитарного состояния среды применяют: 1) определение общей микробной загрязненности; 2) определение санитарно-показательных микроорганизмов.

Санитарно-показательные микроорганизмы – представители нормальной микрофлоры кишечника и дыхательных путей человека и теплокровных животных.

Эти микроорганизмы обладают следующими свойствами:

1) выделяются в среду теми же путями, что и патогенные микробы (с испражнениями из кишечника и с капельками слизи из дыхательных путей);

2) сохраняются в среде те же сроки, что и патогенные микробы;

3) живут только в организме человека или животных и не имеют других мест обитания;

4) не размножаются в среде, поэтому их количество постоянно некоторое время после попадания в среду;

5) методы их определения легкие и доступные (их содержание можно оценить количественно);

6) обладают стабильными и типичными свойствами, поэтому их легко отличить от других видов.

Таким образом, санитарно-показательные микроорганизмы свидетельствуют о загрязненности окружающей среды выделениями (испражнениями, мокротой и пр.) человека и животных.

Если в объектах среды повышается количество санитарно-показательных микробов, то повышается вероятность присутствия в них патогенных и условно-патогенных микробов.

Для разных объектов окружающей среды выбраны определенные санитарно-показательные микробы.

Источник

Среда для выращивания хламидий

Распространенность заболеваний, обусловленных Сhlamydia trachomatis, во всех странах мира столь велика, что вопросам лабораторного подтверждения заболевания посвящены многочисленные конгрессы, конференции, симпозиумы и обширная медицинская литература.

Хламидин относятся к самостоятельному порядку Сhlamydiales, семейству Сhlamydiaceae, имеют один род Сhlamydia, включающий 4 вида: С.psittaci, С.trachomatis, С. pneumoniae, С. pecorum. Возбудителями урогенптальных инфекций являются С.trachomatis.

Сhlamydia trachomatis — облигатно паразитическая бактерия, способная размножаться внутри определенных клеток. Для хламидий характерен своеообразный цикл размножения, который включает две формы существования микроорганизма: элементарные тельца (ЭТ) — мелкие (0,15-0,2 мкм) неподвижные сферические образования и ретикулярные тельца (РТ) — более крупные (около 1 мкм) овальной формы. ЭТ способны к внеклеточному существованию и являются инфекционной формой возбудителя. РТ считают вегетативной неинфекционной формой хламидий. Некоторые исследователи полагают, что существуют особые мельчайшие частицы хламидий, которые ответственны за персистенцию микроорганизма в тех случаях, когда лечение оказывается не эффективным. Наличие таких частиц показано как в клеточных культурах, инфицированных хламидиями, так и in vivo в организме человека.

Цикл размножения хламидий занимает 48-72 ч от момента внедрения в клетку ЭТ до выхода из разрушенной клетки новообразованных ЭТ, способных заражать новые расположенные рядом клетки. В процессе размножения ЭТ преобразуются в переходные тельца, из которых формируются РТ. Также через переходные формы из них образуются ЭТ. Хлaмидии растут, размножаются и созревают в виде микроколонии в цитоплазматнческом пузырьке. При развитии хламидий наблюдается несинхронность цикла. В зрелых цитоплазматических включениях одновременно наблюдаются все формы микроорганизма.

Сhlamydia trachomatis вызывают у мужчин уретрит как в виде острого заболевания, так и в виде бессимптомной инфекции. Обе формы могут давать осложнения — эпидидимит, простатит, синдром Рейтера (конъюнктивит — уретрит — артрит).

У женщин основным заболеванием является цервицит, который представляет собой слизисто-гнойное воспаление слизистой оболочки цервикалмюго канала. На втором месте по частоте поражения стоят уретра и парауретральные железы. Уретрит у женщин менее выражен, чем у мужчин.

Осложнением хламидпйного цервицита является восходящее инфицирование эндометрия (эндометрит), маточных труб (сальпингит), тазовой брюшины (пельвиоперитонит), а также брюшины, покрывающей печень (перигепатит), аппендикс (периаппендицит), сигмовидной кишки (перисигмоидит). Развивающийся воспалительный процесс в брюшине называют синдромом Фитц-Хью-Куртнса.

Генитальный хламидиоз у беременных женщин в 50-60% случаев передается в родах ребенку. У новорожденных развивается слизисто-гнойный конъюнктивит (в 20% случаев) и/или пневмония (в 10% случаев). Описаны также хламидийные назофарингиты, гастроэнтериты, которые, по-видимому, реже привлекают к себе внимание врачей.

Существование бессимптомных форм хламидийной инфекции установлено у 70-80% инфицированных хламидиями лиц. Передача возбудителя происходит при половом контакте, инкубационный период для манифестных форм составляет 5-7 дней. Для бессимптомного скрытого инфекционного процесса продолжительность инкубационного периода не установлена. В диагностике генитального хламидиоза упор делается на лабораторные методы, с помощью которых определяют наличие живых, размножающихся хламидий (культуральный метод), наличие антигенов хламидий с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии или иммуноферментного метода в его различных модификациях, наличие генетического материала хламидий с помощью молекулярно-биологических методов. Можно сказать, что относительная простота и высочайшая чувствительность молекулярно-биологическнх методов делает их предпочтительными в скрининговых исследованиях. Лишь относительно высокая стоимость наборов реактивов и самой аппаратуры ограничивает применение молекулярно-биологическнх методов, хотя внедрение неинвазивных способов получения от пациентов материала для исследования, которые они могут собрать сами (моча, вульво-вагинальные выделения), исследование пулов собранных образцов позволяют снизить материальные затраты на проведение исследований.

Остановимся на характеристике перечисленных диагностических методов.

    Культуральная диагностика

Для взятия материала с целью проведения культуральной диагностики используют специальные тампоны па металлическом стержне или специальные щеточки. Тампон или щеточку вводят в мужскую уретру на 2-4 см, в женскую уретру на 1,5-2 см, в цервикальный канал на 2-3 см, вращают 15 с, извлекают и помещают в транспортную среду. При этом необходимо тщательно удалить ватным тампоном выделения из уретры пли цервикального канала. Пробы должны быть доставлены в лабораторию как можно быстрее, но не позднее чем в течение 24 ч. До транспортировки в лабораторию пробы храпят при температуре 2-8°С. В случае необходимости более длительного хранения пробы замораживают (-70°С).

Для выращивания С.trachomatis применяют перевиваемые клеточные культуры линии МсСоу, L-929, НеLа-920. Клетки выращивают в матрацах со средой 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. После формирования сплошного слоя клетки снимают со стекла 0,02% раствором версена или 0,25% раствором трипсина. Суспензию клеток, содержащую 2,0 х 10 5 клеток в 1 мл среды, вносят в плоскодонные пробирки со стеклами (можно заменить пенициллиновыми флаконами с покровными стеклами, разрезанными на 4 части). Выращивание клеток производят в вертикальном положении пробирок. При наличии СO2-инкубатора клеточную взвесь разливают в панели с лунками, имеющими плоское дно. Сформированный монослой (1 сутки при 37°С) используют для заражения исследуемым материалом. Ростовую среду удаляют, клетки обрабатывают ДЭАЕ-декстраном или раствором циклогексимида. Обработка клеток этими веществами необходима для облегчения проникновения ЭТ в клетки. В пробирки и лунки вносят исследуемый материал в виде его взвеси в транспортной среде с антибиотиками. Дополнительно необходимо центрифугирование зараженной культуры при 2500 об./мbн в течение одного часа в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования инокулят удаляют, в каждую пробирку или лунку вносят среду 199 с 5% сыворотки крупного рогатого скота, 5% глюкозы, 200 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл канамицина.

В табл.4 представлена схема культуральной диагностики урогенитального хламидиоза.

Культуральный метод диагностики хламидиоза

  1. Формирование монослоя клеток на покровных стеклах
    1. Из матраца с растущей культурой клеток удаляют питательную среду.
    2. В матрац с клеточным монослоем вносят 2 мл 0,25% трипсина или 0,02% версена;
    3. Матрац инкубируют несколько минут при 37°C и затем интенсивно встряхивают для отделения клеток от поверхности стекла
    4. Готовят суспензию клеток в ростовой среде с содержанием 10% сыворотки плодов коров (фетальной сыворотки). Густота суспензии — 2 х 10 6 клеток/мл.
    5. В каждую пробирку с покровным стеклом вносят 1 мл клеточной взвеси.
    6. Пробирки инкубируют сутки для формирования монослоя клеток на стекле.
  2. Заражение монослоя клеток на покровных стеклах
    1. Из пробмрок удаляют ростовую среду.
    2. В пробирки с монослоем вносят от 0,1 до 1,0 мл материала от пациента в транспортной среде.
    3. Центрифугируют пробирки при 12500 об./мин при температуре не выше 37°С в течение 1 ч.
    4. Пробирки инкубируют при 37°С в течение 1 ч.
    5. Из пробирок удаляют среду и вносят поддерживающую среду, и которую входят 2% раствор фетальной сыворотки, глюкоза, антибиотики и циклогексимид в концентрации 1-2 мкг/мл.
    6. Зараженные клеточные культуры инкубируют при 37°С в течение 18-72 ч.
  3. Окраска
    1. Из зараженных пробирок удаляют среду, покровные стекла, промывают 1 раз ФСБ.
    2. Монослой клеток фиксируют метанолом или ацетоном в течение 2-5 мин.
    3. Стекла вынимают из пробирок и окрашивают флюоресцирующими антителами согласно инструкции по применению.
    4. Стекла с окрашенным монослоем клеток монтируют на предметном стекле, поверхностью клеток вниз. Просмотр ведут в люминесцентном микроскопе при увеличении х 400 или х 900.

Выявление хламидий в зараженной клеточной культуре производят по прямому иммунофлюоресцентному методу, используя антитела к хламидийному антигену. Наилучшие результаты удается получить при применении специально подготовленных для целей культуральной диагностики флюоресцирующих антител тест-систем. Клетки фиксируют холодным ацетоном, окрашивают специфической антихламидийной сывороткой, отмывают и просматривают в люминесцентном микроскопе. На коричнево-оранжевом фоне цитоплазмы определяются светящиеся ярко зеленые внутриклеточные включения — микроколонии хламидий.

Работа с клеточными культурами требует специальных условий, трудоемка и доступна лишь небольшому числу лабораторий, преимущественно в научно-исследовательских учреждениях. В целях диагностики хламидиоза она применяется редко, главным образом в качестве подтверждающего метода при получении положительного результата с помощью прямой нммунофлюоресценции или молекулярно-биологического метода. При 100% специфичности культурального метода его чувствительность составляет 45-80%.

Культуральный метод незаменим при определении излеченности хламидиоза, так как все остальные методы могут давать искаженные результаты. Кроме того, определение лекарственной чувствительности клинических изолятов хламидий возможно исключительно культуральным методом, пока не будет разработан генный метод определения детерминант резистентности к антибиотикам.

По сравнению с культуральным методом иммуноморфологические методы относительно просты и доступны практически любой лаборатории. Суть методов заключается в выявлении антигенов хламидий непосредственно в микроскопическом препарате, приготовленном из патологического материала (соскобы слизистой оболочки посаженного органа и т.п.). С этой целью обычно используется прямой иммунофлюоресwентный метод — ПИФ, хотя принципиально возможно применение и непрямого метода — НИФ. При постановке метода в настоящее время используют моноклональные антитела к разным антигенам хламидий — липополисахаридному (групповому), основному белковому видовому антигену наружной оболочки хламидий (МОМП), а также антитела к рекомбинантным антигенам хламидий. От качества используемых люминесцирующнх антител зависит чувствительность метода. Для оценки метода ПИФ большое значение имеет качество взятия материала. Необходимо тщательно протереть ватным тампоном шейку матки, удалив слизистую пробку из экзоцервикса, в эндоцервикс на 2-3 см вводится специальная щеточка и вращается 15 с. На предметное стекло вращательным движением наносится материал, в котором должны присутствовать клетки цилиндрического эпителия и отсутствовать клетки десквамированного плоского эпителия, эритроциты и лейкоциты. Результат считается положительным, если при просмотре с помощью люминесцентного микроскопа на оранжево-коричневом фоне клеток в поле зрения обнаруживается не менее 5 ЭТ.

Методы имммуноферментного анализа

Основаны на определении растворимого антигена хламидий методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Постановка реакции требует точного выполнения инструкции. Клинический материал, доставленный в лабораторию, можно хранить 18-36 ч при 4°С. После выполнения всех манипуляции учитывают результат по интенсивности окраски реагирующей среды, которая пропорциональна количеству антигена С. trachomatis, сорбированного на дне панели или на специальном шарике. Интенсивность окраски определяют, фотометрируя пробы при длине волны 492 нм. Чувствительность и специфичность иммуноферментных методов при выявлении хламидийных антигенов относительно низкие — 60-70%.

Основаны на способности нуклеиновых кислот к гибридизации.

В настоящее время самыми распространенными методами молекулярно-биологической диагностики являются полимеразная цепная реакция (ПЦР) и лигазная цепная реакция (ЛЦР). В нашей стране получила распространение ПЦР. Она позволяет производить амплификацию определенных последовательностей нуклеотидов ДНК и РНК микроорганизма путем повторных циклов высокотемпературной денатурации, праймерового нуклеотидного отжигания и опосредованного полимеразой вытягивания цепи. После 30 циклов достигается увеличение в сотни тысяч раз той последовательности, которая исследуется.

Набор аппаратуры и реактивов для ПЦР (скоростная центрифуга, амплификатор, аппарат для электрофореза с трансиллюминатором, реактивы) в нашей стране выпускают несколько фирм.

В ходе ПЦР происходит накопление продуктов амплификации — ампликонов — в таких количествах, что необходимы особые меры предосторожности для предотвращения присутствия даже следов ДНК или РНК разных микроорганизмов в рабочих помещениях, посуде, столах. Требуется разобщение этапов работы в разных комнатах (преамплификационной и послеамплификационной) с отдельной одеждой, перчатками, пипетками и т. п. в каждой из них.

Чувствительность и специфичность метода ПЦР зависит от качества подобранных праймеров.

В настоящее время разработаны методы генной диагностики с амплификацией не мишени, а сигнала, что достигается с помощью иммуноферментной «добавки» для учета результата анализа. Это стандартный метод учета ЛЦР, и он хорошо используется в новых диагностических аппаратах, в которых сигнальная амплификация учитывается по хемилюминесценции.

Во многом применение того или иного метода диагностики хламидиоза зависит от оснащенности лаборатории. В табл.5 приведена сводка преимуществ применения разных методов обнаружения хламидий.

Достоинства и недостатки различных методов обнаружения С. trachomatis (Tailor-Ribinson D. аnd Thomas B.L., и 1991)

ПИФ Культура клеток Иммуноферментные методы ПЦР
Участки тела, которые можно обследовать Любые Большинство Ограничения из-за неспецифичности реакций Любые
Значение правильности взятия проб Решающее Решающее Решающее Решающее
Условия транспортировки проб Если препарат фиксирован — условия не важны Быстрая доставка или хранение при низкой температуре Не имеет значении, если проба взята в буферный раствор Быстрая доставка или хранение при низкой температуре; менее важно, чем для культуры клеток.
Условии хранения На короткое время — при +4С, на длительное — при -20С +4С — сутки. Длительное хранение в жидком азоте 3-5 дней при +4С. Замораживание снижает чувствительность На короткое время — при +4С, на длительное — в жидком азоте
Проверка адекватности взятия материала Мазки оценивают во время тестирования Не практикуется Не практикуется Определяется, присутствует ли ДНК
Потребность в специальном оборудовании Люминесцентный микроскоп Центрифуга Комплект для ИФА Амплифпкатор и оборудование для электрофореза
Обработка проб Простая Трудоемкая Становится проще для новых тестов Требует строгой предосторожности, чтобы не контамнннровать ДНК
Чтение теста Субъективное и утомительное Субъективное, умеренно утомительное Обьективное, простое Объективное, простое
Время выполнения 30 мин 12-72 ч 3 ч 12-24 ч
Способы проверки результата Повторный просмотр Повторный просмотр Повторение теста Повторная проба или переваривание эндонуклеазой
Результат зависит от опыта микроскопнста чувствительности клеточной культуры присущей мощности теста хорошего контроля и отсутствия контаминации
Использование как контроля лечения Ограниченно Рекомендуется Ограниченно Не практикуется
Способность к поддержанию штамма Нет Да Нет Нет

Серологические методы диагностики

Для выявления антител к хламидиям в сыворотке крови в настоящее время используют реакцию микроиммунофлюоресценции и иммуноферментное исследование.

В реакции микроиммунофлюоресценции в качестве антигена используют взвесь элементарных частиц С. trachomatis. На предметное стекло микропипеткой каплями наносят взвесь, фиксируют холодным ацетоном и наслаивают исследуемую сыворотку в двукратных разведениях, начиная с 1:8 до 1:512. Стекла инкубируют при 37°С в течение 30 мин, промывают в фосфатно-солевом буферном растворе. Затем наносят антивидовую флюоресцирующую сыворотку против глобулинов человека. Фон контрастируют синькой Эванса или бычьим альбумином, меченным родамином, и снова тщательно промывают препарат, подсушивают и монтируют его для микроскопии. При люминесцентной микроскопии выявляются ярко-зеленые комплексы антиген-антитело.

Иммуноферментные методы с дифференциацией иммуноглобулинов классов А, М, G к С. trachomatis в настоящее время являются наиболее распространенными. Учитывая динамику образования в инфицированном организме иммуноглобулинов М, А и G, судят об остроте инфекционного процесса. С помощью антигенных диагностикумов из разных иммунотипов С. trachomatis (D. К) можно получить данные о распространенности иммунотипов хламидий в популяции. Следует еще раз напомнить, что серологические методы нельзя использовать для контроля излеченности.

Источник

Читайте также:  Автоматизированные системы сбора урожая
➤ Adblock
detector