Меню

Среда для выращивания культуры микроорганизмов

4.Питательные среды для культивирования микроорганизмов.

По происхождению – естественные(продукты растительного или животного происхождения) и искусственные(определенный хим состав и точное количественное содержание питательных веществ).

Среды делят также на простые(мясная и пептонная вода, бульон и агар) и сложные(к простым средам добавляют углеводы, кровь, сыворотку и т.д.)

В зависимости от свойств, состава и назначения П. с. делят на группы. По консистенции различают питательные среды твердые, полужидкие и жидкие. Примером твердых сред являются 1,5—2% агаровые среды (мясо-пептонный агар, агар Хоттингера), питательная желатина, свернутая сыворотка, свернутый яичный белок, картофель и др. Для приготовления твердых П. с. наиболее часто используют агар-агар, получаемый из морских водорослей. Агар-агар является веществом полисахаридной природы. В воде набухает, образуя студень. Разжижается при t° 70-100° и застывает при 40-50°.

Полужидкой средой является 0,5% агар мясо-пептонный (см.).

К жидким средам относят бульон мясо-пептонный (см.), пептонную воду сахарный бульон, бульон Хоттингера, представляющий собой разведенный (в 4—9 раз) мясной фильтрат.

По целевому назначению – основные(мпа, мпб); специальные(прим.,углеводы для роста стрептоккоков) они делятся , в свою очередь на: избирательные, дифферинциально-диагностические.

5.Техники посева бактерий на жидкие и плотные питательные среды.

Материалом для посева могут быть пересеваемые культуры бактерий, различные выделения животных и человека, ткани трупа, вода, почва, продукты питания. Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку — “зеркало”. Пипетками пользуются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме. Способ взятия плотного материала определяется его консистенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериальной петлей. Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производят над пламенем горелки. Бактериальную петлю прокаливают над пламенем непосредственно перед взятием материала, за

тем петлю остужают. Для этого при пересеве микробной культуры с пробирки горячую петлю погружают в конденсационную жидкость, а при пересеве с чашек Петри прикасаются к поверхности питательной среды, свободной от микробного роста. Достаточно остуженная петля не вызывает шипения конденсационной жидкости и не растапливает агар при соприкосновении со средой. После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся на ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала Пипетки и шпатели, используемые для посевов и опускают в дезинфицирующий раствор.

После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробирках в верхней трети надписывают название засеянного материала, ставят номер анализа и дату посева.

Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды: 1. При посеве в жидкую питательную среду петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду. 2. При посеве на скошенный мясопептонный агар

пробирку берут в левую руку между 1 и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериальной петли, посредством которой производится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынимания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха. Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой (рис.).

3. При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают 1 и II пальцами, а с другой —IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют 1 и III или 1 и II пальцами (рис.). Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на несколько равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользоваться вместо петли тампоном или шпателем. При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида. 4. Из материала, подлежащего посеву в толщу плотной питательной среды, готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1—1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15 — 20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40 — 45 °С (при такой температуре пробирка со средой, приложенная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в питательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола. 5. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.

Читайте также:  Что сделать чтобы почва не была кислой

Источник

Питательная среда

Питательная среда – жидкий, полужидкий или плотный субстрат, используемый для выращивания микроорганизмов (грибов, бактерий и прочее) в лабораторных и производственных условиях [4] .

Содержание:

При культивировании микроорганизмов важно создать оптимальные условия для их роста. Одним из основных факторов успешного культивирования является состав и свойства питательной среды. Универсальной питательной среды, пригодной для роста и развития всех без исключения микроорганизмов не существует, поскольку конструктивные и энергетические процессы микробов различны [3] [1] .

Питательные среды

1. Жидкая питательная среда (мясо-пептонный бульон или МПБ) [2] .; 2. Полужидкая среда (мясо-пептонный желатин или МПЖ) [2] .; 3. Плотная питательная среда (мясо-пептонный агар или МПА) [2]

Виды питательных сред

По составу питательные среды делят на:

  1. Синтетические – представляют собой водные растворы химически чистых соединений в установленных дозировках. Состав таких питательных сред полностью известен, но используются они для немногих видов нетребовательных к питанию микроорганизмов [1] .
  2. Натуральные или естественные – состоят из продуктов животного или растительного происхождения. Химический состав таких сред сложен и точно не определен. К ним относят мясопептонный бульон и агар, солодовое сусло, сусло-агар, обезжиренное и гидролизованное молоко, отвары овощей [1] .

По целевому назначению питательные среды делят на:

  1. Основные – применяются для выращивания многих бактерий. К ним относят мясопептонный бульон (МПБ), триптические гидролизаты рыбных, мясных продуктов, казеина. Основные среды служат для приготовления сложных питательных сред. К ним добавляют молоко, сахар, кровь и прочие ингредиенты [1] .
  2. Селективные (избирательные) – предназначены для выделения и накопления микроорганизмов определенных видов или групп из объектов, содержащих разнообразную микрофлору. Сопутствующие микробы или совсем не растут на селективных средах или развитие их сильно подавляется. Разработка таких питательных сред основывается на биологических особенностях конкретных микроорганизмов, отличающих их от многих других [1] .
  3. Дифференциально-диагностические – позволяют быстро устанавливать и отличать группы микроорганизмов друг от друга. Их состав подбирается с расчетом четкого выявления характерных свойств конкретного вида. Во многих случаях это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов, окрашивающих колонии определяемых микробов в конкретные цвета [1] .

По физическому состоянию питательные среды делят на:

  1. Жидкие (бульоны) – используют для накопления биомассы микробов, продуктов их метаболизма, а так же для выявления физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов [1] .
  2. Полужидкие – питательные среды, содержащие от 0,08 до 0,7% агара [1] .
  3. Плотные – готовятся из жидких питательных сред, путем добавления желирующих веществ – агара или желатина (1,5–2,0%). Данные вещества при растворении в горячей воде формируют коллоидный раствор, дающий при охлаждении плотный гель (студень). Студеобразные среды возможно расплавить при помощи нагревания. Плотные среды используют для выделения чистых культур микроорганизмов: в диагностических целях, для количественного учета микроорганизмов, определения протеолитической и антагонистической активности [1] .
  4. Сухие – выпускаются специализированными предприятиями, используются в микробиологических целях. Перед использованием в них добавляют воду и стерилизуют [1] .

Культура бактерии Xanthomonas axonopodis

Селективная питательная среда [5]

Требование к питательным средам

Для культивирования микроорганизмов используют различные по составу питательные среды. Но все они должны соответствовать ряду общих требований:

  • содержать полный набор веществ необходимых для питания, выращиваемого микроорганизма, в легко усвояемой форме;
  • обладать оптимальной влажностью, вязкостью, кислотностью среды (pH);
  • быть изотоничными ( с осмотическим давлением равным осмотическому давлению внутри клетки);
  • по возможности – быть прозрачными [3][1] .

Основные компоненты любой питательной среды – источники азота и углерода. Их количественное отношение является определяющей характеристикой большинства сред [3] .

Автотрофные микробы требовательны к наличию углекислого газа, поскольку его концентрация в воздухе составляет только 0,03 %. Для обеспечения питательных сред углекислым газом вносят обычно карбонат кальция (СаСО3), иногда – гидрокарбонат натрия (NaHCO3), либо другие карбонаты. В некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обогащенный углекислым газом до 1–5% [3] .

Читайте также:  Машины для вспашки почвы

Гетеротрофные организмы успешно развиваются на средах, содержащих источники углерода в виде органических соединений. В зависимости от индивидуальных особенностей гетеротрофные микроорганизмы используют разнообразные органические соединения – спирты, органические кислоты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. Обычно в лабораторной практике в качестве источника углерода применяют глюкозу, поскольку именно это соединение углерода легче всего утилизируется микробами [3] .

Потребности в источниках азота удовлетворяются азотосодержащими соединениями, с разной степенью восстановленности азота. В основном, это соли аммония, вносимые в питательную среду в форме сульфатов и хлоридов. При использовании этих веществ необходимо учитывать их высокую физиологическую кислотность, влияющую на кислотность среды и развитие микроорганизмов. Кроме того, потребность в азоте удовлетворяется нитратами. Нитриты используются очень редко, поскольку токсичны для многих микроорганизмов [3] .

Не маловажными для построения веществ микробной клетки являются соединения фосфора, серы, калия, магния, кальция и других элементов, которые так же должны содержаться в питательной среде в доступной форме. Их потребность удовлетворяется за счет минеральных солей [3] .

Потребность в сере удовлетворяются сульфатами. В фосфоре – солями фосфорной кислоты. Все необходимые металлы и прочие элементы – в форме катионов или анионов неорганических солей. В частности, источник магния – сульфат магния (MgSO4), натрия – хлорид натрия или поваренная соль (NaCl), кальция – хлорид кальция (CaCl2) или карбонат кальция (CaCO3).

Для нормального развития микробов, в том числе бактерий, необходимы так называемые факторы роста (аминокислоты, азотистые основания, витамины, жирные кислоты, железоприны и многие другие соединения). Их добавляют в питательные среды в значительно меньшем количестве, чем макроэлементы [3] .

Потребность в нескольких аминокислотах удовлетворяют, добавляя гидролизат белка. Для его получения используют белки животного или растительного происхождения. В первом случае это мясо, рыба, желатин, казеин. Во втором – семена сои, подсолнечника, кукурузы. Источником аминокислот могут служить клетки микроорганизмов – дрожжи, водоросли, бактерии [3] .

Гидролиз проводится с использованием протеолитических ферментов, кипячением крепких щелочей или минеральных кислот. Некоторые натуральные вещества (дрожжевой или кукурузный экстракт) содержат несколько факторов роста (минеральные соли, витамины, аминокислоты) [3] .

Использование питательных сред

Питательные среды используются для:

  • выделения чистых культурбактерий из биогенных и абиогенных объектов;
  • для определения культуральных и ферментативных свойств микробов;
  • для определения устойчивости микробов к химическим, биологическим и физическим факторам;
  • для накопления микробной биомассы и продуктов биосинтеза;
  • для хранения музейных культур [4] .

Источник

Среда для выращивания культуры микроорганизмов

1. Основные принципы и условия культивирования бактерий. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам. Особенности культивирования грибов и простейших.

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды, необходимых для их жизнедеятельности. В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах.

Условия культивирования микроорганизмов

Для роста микроорганизмов существенное значение имеет состав питательной среды, кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы.

Большинство бактерий лучше всего растут при рН, близком к 7,0. Микроскопические (плесневые и дрожжевые) грибы предпочитают слабокислые среды. В случае необходимости кислотность среды доводят до нужного значения растворами кислот, щелочей или солей, имеющих кислотную реакцию (Na2CO3, NaHCO3). Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе культивирования микроорганизмов. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Чтобы избежать этого, в среды добавляют буферные растворы (чаще фосфатные) или избыточное количество мела.

Аэрация. Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки всегда в больших количествах. Однако значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода (группа облигатных аэробов). Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода (облигатные анаэробы). Существует также переходные группы микроорганизмов по потребности в кислороде.

Для выращивания аэробных форм микроорганизмов чаще всего используется метод поверхностного культивирования на плотных и жидких питательных средах. Питательные среды разливают тонким слоем в посуду с широким дном, обычно в чашки Петри. Для получения аэробного роста в большом объеме жидкой среды требуется дополнительная аэрация. Для этого используются различные устройства, обеспечивающие постоянное перемешивание среды путем встряхивания или вращения сосудов. Можно пропускать стерилизованный воздух через жидкость под давлением с помощью пористых разбрызгивателей или обеспечивать механическое перемешивание специальными механизмами.

Читайте также:  Как заняться выращиванием винограда

Для роста строго анаэробных микроорганизмов нужно исключить попадание кислорода в среду инкубации. Для этого среды перед посевом кипятят, посевы выдерживают в герметически закрытых сосудах или в специальных вакуумных анаэростатах, из которых с помощью насосов выкачивается воздух, или воздух в них заменяется каким-нибудь инертным газом (например, азотом). В анаэростат можно добавлять различные вещества, поглощающие кислород – щелочной пирогаллол, хлорид одновалентной меди и др. Кроме того используют разные приёмы: выращивание в высоком слое среды; культивирование в вязких средах; выращивание в толще плотной среды.

При культивировании автотрофных микроорганизмов, использующих в качестве источника углерода углекислый газ, добавляют в среду NaHCO3.

Температура. Интервал температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируется. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам микроорганизмов, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37ºС. У термофилов он значительно выше: от 45 до 80–90ºС. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5–10ºС. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влияют на развитие микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая температура. Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.

Вода. Рост микроорганизмов невозможен без присутствия в окружающей среде воды, причём вода должна находиться в доступной для клетки форме, то есть в жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молекулами растворённых веществ и не может быть использована микроорганизмами. Различную активность воды в питательной среде создают добавлением к ним таких соединений, как NaCl, KCl, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль.

Пищевые потребности микроорганизмов и требования

к питательным средам:

Для выделения, выращивания и длительного сохранения микроорганизмов в культурах используют различные питательные среды, содержащие все вещества, необходимые для их роста. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Однако выделяют основные группы необходимых питательных веществ.

1. Источники углерода. По потребности в углероде микроорганизмы принято делить на автотрофы и гетеротрофы. Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислый газ. Для культивирования автотрофов в среды вносят бикарбонат натрия или карбонаты. В некоторых случаях через среду продувают воздух, обогащённый 1–5 % углекислого газа. Для культивирования гетеротрофов среда должна содержать органические вещества – кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения.

2. Источники азота. Потребности микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими соединениями. Для очень многих микробов это могут быть неорганические соединения – соли аммония, нитраты. Потребности других микроорганизмов в азоте удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка или аминокислоты. Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления – пептоны, представляющие собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотистых оснований, солей и микроэлементов. Пептоны получают в результате воздействия протеолитических ферментов на белки животного или растительного происхождения.

3. Минеральные соли. Микроорганизмам для построения веществ клетки кроме углерода и азота необходимы также сера, фосфор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в среде в доступной форме. Потребности в этих элементах обычно удовлетворяются за счёт минеральных солей – сульфатов, фосфатов и хлоридов магния, кальция, натрия, железа и др.

4. Микроэлементы. Потребности микроорганизмов в микроэлементах (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт) очень малы. Питательные среды с пептоном, почвенной вытяжкой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом казеина содержат необходимые микроэлементы. В состав синтетических сред микроэлементы необходимо дополнительно вносить.

5. Факторы роста. Многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания. Чтобы подчеркнуть потребность микробов в факторах роста, принято использовать термины прототрофы и ауксотрофы. Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или несколько факторов роста. Примерами смесей, содержащих различные факторы роста, могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт.

Существует ряд требований, предъявляемых к питательным средам:

1. среды должны содержать полный набор необходимых питательных веществ;

2. среды должны быть изотоничными (для большинства микроорганиз-мов концентрация солей не должна превышать 0,5 %);

3. кислотность среды должна быть нейтральной или слабощелочной (pН=6–8). В процессе культивирования микроорганизмов в среду могут выделяться метаболиты, изменяющие рН среды настолько, что рост микроорганизмов существенно замедляется или даже становится невозможным. Чтобы избежать изменения рН, в среду добавляют буферные системы, чаще фосфатные (они малотоксичны для микроорганизмов и используются ими также в качестве источника фосфора);

Источник

➤ Adblock
detector