Среда для выращивания лактобактерий

Агар используют в качестве селективной среды для выращивания лактобактерий орального и фекального происхождения.

Состав**:

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 75,0 г порошка М130 или 60,0 г порошка М407 в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Добавить 1,32 мл ледяной уксусной кислоты. Тщательно перемешать и разлить в культуральные пробирки или флаконы. Прогреть при 90-100°С в течение 2-3 минут. Остудить до 45°С для прямого посева. НЕ АВТОКЛАВИРОВАТЬ СРЕДУ.

Принцип и оценка результата:

Эти среды являются модификациями сред, описанных Rogosa и соавт. (1). Они дают прекрасные результаты при качественных и количественных исследованиях на лактобактерии фекалий, физиологического раствора или молочных продуктов.

Триптоза или гидролизат казеина и дрожжевой экстракт обеспечивают присутствие азотистых веществ, витаминов группы В и микроэлементов, необходимых для роста лактобактерий. Глюкоза, арабиноза и сахароза являются ферментируемыми углеводами. Твин-80 – источник жирных кислот.

Аммония цитрат и ацетат натрия подавляют рост плесневых грибов, стрептококков и многих других микроорганизмов. Низкое значение рН и добавление уксусной кислоты подавляет рост сопутствующей микрофлоры, делая среду селективной для лактобактерий (2).

Чашки со средой рекомендуется инкубировать при 30°С в течение 5 дней или при 37°С в течение 3 дней в атмосфере 95% водорода и 5% углекислого газа (3). Если это невозможно, то перед инкубированием чашки рекомендуется залить вторым слоем агара. Высокая концентрация ацетата и кислое значение рН подавляют рост многих штаммов других молочнокислых бактерий. Для последующей идентификации все колонии рекомендуется проверять в пробе на каталазу и путем микроскопии окрашенных по Граму мазков.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий светло-желтый порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному агаровому гелю (М130).

Цвет и прозрачность готовой среды:

Среда имеет светло-желтую окраску, слегка опалесцирует, если в чашках Петри формируется гель.

Кислотность среды:

При 25°С водные растворы М130 (7,5% вес/об) и М407 (6,0% вес/об) с добавлением до 0,132% уксусной кислоты имеют рН 5,4 ± 0,2.

Культуральные свойства:

Ростовые характеристики референс-штаммов через 40-48 ч при 35-37°С в атмосфере 95% водорода и 5% углекислого газа.

Ссылки:

1. Rogosa M., Mitchell J.A. and Wiseman R.F., 1951, J. Bact., 62(1) : 132.
2. MacFaddin J.F., 1985, Media for Isolation-Cultivation-Identification-Maintenance of Medical Bacteria, Vol. I, Williams and Wilkins, Baltimore.
3. Sharpe M., 1960, Lab-Practice, 9(4) : 223.

Условия и сроки хранения:

Порошок хранить при температуре ниже +8°С. Использовать до даты, указанной на этикетке. Готовую среду хранить не рекомендуется.

Источник

Питательная среда для выращивания лактобактерий

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, медицинской и ветеринарной промышленности, в частности при производстве лечебных бакпрепаратов. Питательная среда для выращивания лактобактерий содержит следующие компоненты, г/л: глюкоза 15,0-25,0; панкреатический гидролизат казеина с аминным азотом 350 мг% 10,0-20,0, сульфат марганца 0,02-0,03, сульфат магния 0,05-0,15, автолизат пекарских дрожжей 15,0-97,5, фосфат калия двузамещенный 0,5-1,5, ацетат натрия 2,0-3,0, цитрат аммония 0,5-1,5, вода дистиллированная до 1 л. Изобретение обеспечивает повышение стандартности и технологичности среды и снижение ее стоимости. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, медицинской и ветеринарной промышленности, в частности при производстве лечебных биопрепаратов.

Наиболее близкой к заявляемой по технической сущности и достигаемому результату, выбранной в качестве прототипа, является питательная среда МРС-1 (среда Rogosa) (ФС 42-252 ВС-89 «Лактобактерин сухой»). Среда содержит глюкозу, автолизат пекарских дрожжей, фосфат калия двузамещенный, цистеин солянокислый, сульфат марганца, сульфат магния, раствор пептона с твином-80, гидролизованное молоко по Богданову и воду дистиллированную.

Недостатком известной среды являются: высокая стоимость из-за наличия дорогостоящего импортного вещества — цистеина солянокислого, нестандартность из-за наличия в составе среды в качестве источника азота гидролизованного молока по Богданову, сложность технологии приготовления среды из-за операции суспендирования в горячей воде пептона перед внесением в среду.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением — совершенствование питательной среды.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении стандартности и технологичности среды и снижении ее стоимости.

Указанный результат достигается тем, что питательная среда для выращивания лактобактерий, содержащая источник азота, глюкозу, автолизат пекарских дрожжей, фосфат калия двузамещенный, сульфат марганца, сулфат магния, воду дистиллированную, дополнительно содержит ацетат натрия и цитрат аммония, а в качестве источника азота — панкреатический гидролизат казеина с аминным азотом 350 мг% при следующем соотношении компонентов, г/л: Глюкоза — 15,0-25,0 Панкреатический гидролизат казеина с аминным азотом 350 мг% — 10,0-20,0 Сульфат марганца — 0,02-0,03 Сульфат магния — 0,05-0,15 Автолизат пекарских дрожжей — 15,0-97,5 Фосфат калия двузамещенный — 0,5-1,5 Ацетат натрия — 2,0-3,0 Цитрат аммония — 0,5-1,5 Вода дистиллированная — до 1 л
Питательную среду готовят следующим образом.

Для приготовления используют сульфат марганца по ГОСТ 435-77, сульфат магния по ГОСТ 4523-77, фосфат калия двузамещенный по ГОСТ 2493-75, ацетат натрия по ГОСТ 199-78, цитрат аммония по ТУ 6-09-01766-90. Очищенную воду готовят по ФС 42-2619-97.

Для приготовления панкреатического гидролизата казеина замороженную поджелудочную железу крупного рогатого скота оттаивают, измельчают в мясорубке и помещают в металлические бачки. Казеин, соответствующий ГОСТ 17626-81, взвешивают на весах и загружают в реактор, заливают питьевой водой при температуре (421) o С. Смесь оставляют на 2 ч для набухания. Затем при включенной мешалке дробно вносят раствор натрия гидроокиси 20%-ный до рН (7,8-8,0).

В реактор с подготовленным казеином добавляют промолотую поджелудочную железу, включают мешалку, перемешивают, 20%-ным раствором натрия гидроокиси коррегируют рН до (7,8-8,0), добавляют хлороформ. Реактор закрывают и проводят гидролиз при температуре (421) o С в течении 5-7 суток с периодическим перемешиванием автоматической мешалкой (каждые 2 ч по 3-5 мин), поддерживая в гидролизате первоначально установленное значение рН.

Процесс гидролиза контролируют по нарастанию аминного азота в первые, третьи, пятые сутки. Об окончании процесса гидролиза судят по прекращению нарастания аминного азота. В готовом гидролизате содержание аминного азота — (0,48-0,60)%, пептидов — (1,8-2,4)%, триптофана — (110-120) мг%, хлоридов — (0,18-0,24)%. Определение всех показателей проводят по «Методическим указаниям по физико-химическому контролю питательных сред» и ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов».

Для приготовления автолизата пекарских дрожжей дрожжи пекарские измельчают на куски, заливают теплой питьевой водой, выдерживают при температуре 462 o С в течении 222 ч. Затем смесь кипятят и отделяют осадок от раствора. Содержание аминного азота 140 мг%.

Панкреатический гидролизат казеина с аминным азотом 350 мг% в количестве 0,1-0,2 л соединяют с автолизатом пекарских дрожжей (0,1-0,65 л), перемешивают и добавляют остальные компоненты: глюкозу в количестве 0,015-0,025 кг; сульфат марганца — 0,02-0,03 г; сульфат магния — 0,05-0,15 г; фосфат калия двузамещенный — 0,5-1,5 г; ацетат натрия — 2,0-3,0 г; цитрат аммония — 0,5-1,5 г и доводят объем раствора до 1 л очищенной водой. рН раствора коррегируют 20% раствором натрия гидроокиси до 7,10,1. Смесь перемешивают.

Выращивают лактобактерии в предлагаемой питательной среде следующим образом.

В начале выращивают штамм L. plantarum (8P-A3) на среде Мозэра-Рогоза-Шарпа в течение 162 ч при 371 o С. Полученный инокулят засевают в предлагаемую среду в количестве 10% от объема среды. Выращивают лактобактерии в течение 162 ч в термостате при 371 o С.

Показатели среды определяли по ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов».

Рост культуры лактобактерии определяли по показателям оптической плотности и содержанию живых микробных клеток.

0,1 л панкреатическогo гидролизата казеина с аминным азотом 350 мг% соединяют с 0,65 л автолизата пекарских дрожжей, перемешивают и добавляют глюкозу 0,015 кг, сульфат марганца 0,02 г, сульфат магния 0,15 г, фосфат калия двузамещенный 0,5 г, ацетат натрия 2,0 г, цитрат аммония 0,5 г и доводят объем раствора до 1 л очищенной водой. рН раствора коррегируют 20% раствором натрия гидроксида до 7,1 0,1. Смесь перемешивают.

Пример 2 проведен аналогично примеру 1. Данные сведены в таблицу.

Уменьшение количеств глюкозы менее 0,015 кг/л, так же как и увеличение более 0,025 кг/л, приводит к снижению роста культуры.

Уменьшение количеств панкреатического гидролизата казеина менее 0,1/л и автолизата пекарских дрожжей менее 0,10 л/л снижает ростовые свойства среды, а увеличение их количеств более 0,40 л/л и 0,65 л/л соответственно технологически нецелесообразно.

Уменьшение количеств всех солей, кроме ацетата натрия, входящих в состав питательной среды, ниже их нижних пределов приводит к снижению ростовых свойств среды, а увеличение выше верхних пределов технологически нецелесообразно.

Уменьшение количества ацетата натрия менее 2,0 г/л, так же как и увеличение более 3,0 г/л, приводит к нарушению буферных свойств среды.

Предлагаемая питательная среда для выращивания лактобактерий имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:
— улучшаются ростовые свойства среды;
— при сохранении достаточно высокого количества живых микробных клеток снижается стоимость среды за счет исключения импортного химического реактива.

Питательная среда для выращивания лактобактерий, содержащая источник азота, глюкозу, автолизат пекарских дрожжей, сульфаты марганца и магния, фосфат калия двузамещенный, воду дистиллированную, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит ацетат натрия и цитрат аммония, а в качестве источника азота — панкреатический гидролизат казеина с аминным азотом 350 мг% при следующем соотношении компонентов, г/л:
Глюкоза — 15,0-25,0
Панкреатический гидролизат казеина с аминным азотом 350 мг% — 10,0-20,0
Сульфат марганца — 0,02-0,03
Сульфат магния — 0,05-0,15
Автолизат пекарских дрожжей — 15,0-97,5
Фосфат калия двузамещенный — 0,5-1,5
Ацетат натрия — 2,0-3,0
Цитрат аммония — 0,5-1,5
Вода дистиллированная — До 1 л

Источник

Среда для выращивания лактобактерий

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно к получению питательных сред для культивирования лактобактерий, и может быть использовано для производства пробиотических препаратов.

Известна питательная среда МРС, которая является классической для культивирования лактобактерий (Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. — М.: Наука, 1975. — С.64). Она включает, масс.%:

Среда обладает основными ростовыми свойствами, необходимыми для лактобактерий, но недостатком данной среды является труднодоступность и многочисленность компонентов, кроме того, она не позволяет получить достаточно высокую (свыше 10 9 КОЕ/мл) плотность роста лактобактерий.

Известна питательная среда для выделения лактобактерий (заявка №2012154888/10), включающая капустный отвар, глюкозу, агар, молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат и уксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, масс.%:

Недостатком данной среды является то обстоятельство, что она предназначена только для выделения лактобактерий из различного материала, однако она не позволяет получить значительную биомассу бактерий, а следовательно, не может быть использована для производства пробиотических препаратов.

Описана питательная среда, которая является наиболее близкой по сути предлагаемому изобретению и поэтому взята авторами за прототип, она включает отвар капусты — 500,0 мл, куда добавлены натрий фософорнокислый — 2,0 г, магний сернокислый — 1,0 г, пептон — 5,0 г, глюкоза — 10,0 г, лимоннокислый натрий — 10,0 г. При этом отвар капусты готовят следующим образом: 500,0 г свежей капусты кипятят 30 мин в 1 л водопроводной воды. В полученный отвар добавляют ингредиенты и стерилизуют (Дзержинская И.С. Питательные среды для выделения и культивирования микроорганизмов: Учебное пособие. — Астрахань: Издательство АГТУ, — 2008. — 236 с.).

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание доступной, экономичной и легко воспроизводимой в любой микробиологической лаборатории питательной среды для культивирования лактобактерий.

Технический результат достигается тем, что получена питательная среда для культивирования лактобактерий, включающая отвар капусты, глюкозу и дополнительные источники питания, отличается тем, что в качестве дополнительных источников питания содержит кислотный гидролизат крови убойных животных, дрожжевой аутолизат и молочную сыворотку при следующем соотношении компонентов, масс.%:

Позитивное влияние дрожжевого аутолизата и сывороточных белков молока на рост лактобактерий и буферные свойства среды известно и широко используется в микробиологии и биотехнологии. Обоснованием ввода в питательную среду для культивирования лактобактерий кислотного гидролизата крови убойных животных является его химический состав, который включает заменимые и незаменимые аминокислоты и минералы в органической форме. В аминокислотный состав кислотного гидролизата крови входят (г/л): аспарагиновая аминокислота — 1,55-2,61, глутаминовая аминокислота — 2,46-3,43, серин — 1,24-1,62, глицин — 1,0-1,33, гистидин — 0,81-1,42, треонин — 2,10-3,38, аланин — 2,48-3,09, пролин — 0,57-0,69, аргинин — 1,74-2,05, тирозин — 0,16-0,68, метионин — 0,11-0,27, валин — 1,08-1,58, изолейцин — 0,77-1,20, лейцин — 1,77-2,48, фенилаланин — 1,55-1,94, лизин — 2,29-2,78. В минеральный состав кислотного гидролизата крови входят (мг/л): кальций — 500-700, магний — 130-200, железо — 80-125, цинк — 27-40, марганец — 0,6-1,7, медь — 0,53-0,8, кобальт — 0,10-0,17, селен — 0,008-0,01, йод — 0,0006-0,001. Использование кислотного гидролизата крови в составе питательной среды для лактобактерий исключает дополнительный ввод различных аминокислот и солей микро- и макроэлементов.

Сочетание в предлагаемой питательной среде компонентов растительного и животного происхождения за счет наличия всех необходимых питательных и стимулирующих ингредиентов обеспечивает высокую скорость роста лактобактерий и значительное накопление их биомассы в течение 24 ч. Предлагаемую питательную среду готовят следующим образом. Кислотный гидролизат крови предварительно раскисляют с помощью 10% раствора гидроксида натрия до pH 6,7-6,9, после чего добавляют в него дрожжевой аутолизат, молочную сыворотку, глюкозу и доводят объем до 100% отваром капусты. Полученную смесь нагревают до кипения, кипятят 5-7 минут, при необходимости доводят pH до 6,7-6,9, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам и стерилизуют автоклавированием, получая питательную среду для культивирования лактобактерий со следующим соотношением компонентов, масс.%:

По сравнению с прототипом предлагаемая среда обогащена гидролизатом крови, дрожжевым аутолизатом и молочной сывороткой, что значительно улучшает ее ростовые свойства и обеспечивает высокую скорость роста лактобактерий и накопление их биомассы.

Ниже приведены примеры обоснования соотношения компонентов питательной среды для культивирования лактобактерий и ее сравнительную эффективность.

Пример 1. В качестве тест-объекта использовали Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 7,0, дрожжевой аутолизат 7,0, молочная сыворотка 7,0, глюкоза 1,7, отвар капусты — остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 3,1×10 9 КОЕ/мл.

Пример 2. В качестве тест-объекта использовали Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 8,0, дрожжевой аутолизат 8,0, молочная сыворотка 8,0, глюкоза 1,8, отвар капусты — остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 9,6×0 9 КОЕ/мл.

Пример 3. В качестве тест-объекта использовали Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 9,0, дрожжевой аутолизат 9,0, молочная сыворотка 9,0, глюкоза 1,9, отвар капусты — остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 5,5×10 10 КОЕ/мл.

Пример 4. В качестве тест-объекта использовали Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 10,0, дрожжевой аутолизат 10,0, молочная сыворотка 10,0, глюкоза 2,0, отвар капусты — остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 9,1×10 10 КОЕ/мл.

Пример 5. В качестве тест-объекта использовали Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 11,0, дрожжевой аутолизат 11,0, молочная сыворотка 11,0, глюкоза 2,1, отвар капусты — остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 6,4×10 10 КОЕ/мл.

Пример 6. В качестве тест-объекта использовали изолят Lactobacillus plantarum, выделенный из кишечного тракта теленка. Данный изолят культивировали на питательной среде следующего состава, масс %: кислотный гидролизат крови убойных животных 12,0, дрожжевой аутолизат 12,0, молочная сыворотка 12,0, глюкоза 2,2, отвар капусты — остальное. Посевная доза составляла 1000 клеток. Через 24 ч культивирования при 37°C концентрация бактерии составила 7,9×10 10 КОЕ/мл.

Таким образом, результаты исследований позволили выявить оптимальные варианты соотношения компонентов питательной среды, обеспечивающие высокий выход биомассы лактобактерий при минимальных затратах — это среда, приготовленная по примерам 3 и 4.

Пример 7. Готовят питательную среду по примеру 3 и 4, а также среду-прототип, в которые вносят Lactobacillus plantarum в количестве 1000 клеток. Через 6, 12 и 24 ч из культуральных сред отбирают пробы для определения численности лактобактерий и pH среды. Результаты опыта представлены в таблице. Из данной таблицы видно, что заявляемая среда, приготовленная по примерам 3 и 4, превосходит по ростовым свойствам прототип, т.к. она спустя 12-24 ч содержала в 100-1000 раз больше клеток лактобактерий, чем прототип. Кроме того, заявляемая среда обладает большей буферностью, чем прототип, поскольку в ней при значительно большей численности лактобактерий значение pH только на 0,4 единицы было ниже. Этот показатель авторы также считают позитивным, т.к. резкое повышение кислотности среды приводит к быстрой гибели лактобактерий.

Таким образом, предлагаемая питательная среда обеспечивает интенсивный рост лактобактерий и накопление биомассы, а следовательно, может быть использована в исследовательских целях и для создания пробиотических препаратов.

Питательная среда для культивирования лактобактерий, включающая отвар капусты, глюкозу и дополнительные источники питания, отличающаяся тем, что в качестве дополнительных источников питания содержит кислотный гидролизат крови убойных животных, дрожжевой аутолизат и молочную сыворотку при следующем соотношении компонентов, масс.%:

Источник