Среда для выращивания микоплазмы

Среда для выращивания микоплазмы

1.3. Питательные среды для культивирования микоплазм

Трудности выделения микоплазм и ахолеплазм из различных объектов постоянно вынуждали исследователей вести поиски наиболее оптимальных питательных сред для выделения и поддержания этих микроорганизмов, поскольку они не имеют клеточной стенки, трудно адаптируются на питательных средах, растут медленно и очень требовательны к различным биологически активным компонентам, т.е. по мнению СП. Борхениуса и О.А. Черновой, (1989), ограниченные метаболические возможности микоплазм естественно определяют сильную зависимость этих микроорганизмов от ростовой среды, от присутствия в ней многих специфических, в том числе богатых энергией соединений. В настоящее время для культивирования микоплазм предложено значительное количество питательных сред. Подавляющее большинство их состоит из трех основных компонентов (питательная основа, дрожжевой экстракт, сыворотка или асцитическая жидкость), а отличаются друг о г друга типом и методом приготовления.

Длительное время исследователи использовали для выделения этих возбудителей бульон Мартена и лошадиную сыворотку, с течением времени среды постепенно обогащались питательными добавками (витаминами, аминокислотами, минеральными солями), необходимыми для роста микоплазм.

Питательная основа составляет большую часть среды, которую получают с помощью различных технологий и животноводческих продуктов Ферментативное переваривание животных тканей (J 1. Schoetensack, 1934; A. Turner 1935; Т. Barber, J. Fabricant, 1962). Настой сердечной мышцы крупного рогатого скотэ с добавлением 1% пептона (D. Edward, W. Fitzgerald, 1951). Обезвоженная вытяжка бычьего сердца и бакто-пептон (W. Morton, 1951), в дальнейшем ‘обезвоженная питательная среда в виде бакто-PPLO бульона или агара (Difco). Триптический перевар конины или трипти-ческий перевар сердца крупного рогатого скота (Е. Klieneberger-Nobel. 1959, R. Lemcke, 1965; П.М. Митрофанов, 1982). Триптический перевар сердца крупного рогатого скота (В.Д. Тимаков, Г.Я. Каган, 1973).

Добавление дрожжевого экстракта обогащает питательную среду и повышает скорость роста микоплазм, наиболее требовательных к составу питательных сред (Т. Barber, J. Fabricant, 1962; R. Chanock, L. llayflick, M. Barile, 1962). Определенное значение имеет также технология приготовления дрожжевого экстракта. R. Lemcke (1965), ссылаясь на неопубликованные данные Hers, указывает, что автором были внесены ценные изменения в рецепт приготовления дрожжевого экстракта, которые в значительной степени улучшали качество среды Хсйфлика. Он отмечает, что вместо кипячения Hers предложил экстрагировать суспензию дрожжей при температуре 80° и рН 4,5, я затем пропускать ее через стерилизующие пластинки фильтра Зейтца. Поскольку готовый дрожжевой экстракт имел кислую реакцию, для восстановления рН питательной среды до значения 7,8—8,0 автор рекомендовал добавлять к питательной среде КППЧЦ, что обеспечивало рост типичных колоний с четко выраженным врастающим в агар центром и окружающей его периферической зоной.

Сыворотка крови является самым важным компонентом, входящим в состав питательных сред, в то же время количественные и качественные характеристики ее различны. В 1935 году Tang с соавторами испытали влияние сывороток различных видов животных на развитие возбудителя перипневмонии крупного рогатого скота и установили, что сыворотки лошадей, овец и кроликов благоприятно влияли на развитие этих микроорганизмов. В то время как сыворотки морских свинок, крупного рогатого скота были мало пригодны для этих целей. Аналог ичные выводы сделал D. Edward (1950) в отношении сыворотки крупного рогатого скота при изучении 17 штаммов микоплазм различного происхождения. По заключению W. Morton (195!), асцидная жидкость и кроличья сыворотка в 20%-й концентрации, являются наиболее оптимальными добавками для изоляции микоплазм от человека. Остальные, испытанные автором, сыворотки в концентрации выше 10% в некоторой степени обладали задерживающим действием. По данным Я.Р. Коваленко с соавторами (1976), свиная и лошадиная сыворотка в 20%-й концентрации благоприятно влияют на развитие шести исследованных видов микоплазм, в то время как сыворотка крупного рогатого скота в концентрации 10% и более оказывала ингибирующее действие на некоторые виды этих микроорганизмов. Оценивая качество сывороточной фракции PPLO (Difco), которая иногда используется вместо сыворотки Н. Bacrnstein. J. Quilligan (1963), установили, что эта фракция не заменяет цельной сыворотки и часто не обеспечивает удовлетворительного развития некоторых видов микоплазм. В качестве дополнительных факторов роста микоплазм отдельные исследователи рекомендовали: Е. Klieneberger-Nobel (1962), вносить в питательные среды 5%-ю суспензию эритроцитов, а так же некоторые аминокислоты, сахара, витаминые и минеральные добавки; D. Edward, W. Fitzgerald (1951), включать ДНК тимуса и муцин свиных желудков, Г Р. Гаджисва, Э.М. Ахмедова, И.В. Раковская и Н.А. Гамова (1987), аргинин, цистин, глюкоза, тиаминобромид, натрий углекислый; Э.М. Ахмедова, М.М. Меджвдов и С.М.А. Омаров, (2000) предложили витаминный препарат «ЭКД». Все перечисленные выше компоненты являются основными и определяющими качество питательной среды в отношении ее ростовых свойств. Второе главное свойство среды — это ее селективность, т.е. избирательность в отношении посторонней микрофлоры, поэтому для подавления бактериальных коптам и пантов добавляют пенициллин, уксуснокислый таллий, сульфадимезин, гюлимиксии

В, ампициллин и другие антисептики, к которым микоплазмы и ахолеплазмы не чувствительны.

Несмотря на многочисленность питательных сред, рекомендованных для выделения и культивирования микоплазм, до настоящего времени не создано универсальной питательной среды, которая могла бы обеспечить удовлетворительное развитие всех известных видов этих микроорганизмов. Это объясняется различным рН, так как одним микоплазмам требуется сдвиг в щелочную сторону, а другим — в кислую. Микоплазмы и уреаплазмы являются стсролозависимымн. а ахолеплазмы, наоборот, поэтому следует учитывать концентрацию и видовую специфичность используемой сыворотки в питательной среде, а так же действие ингибирующих факторов (антибиотики, сульфаниламиды и т.д.).

13 то же время культуральный метод диагностики микоплазмоза является наиболее достоверным с микробиологической точки зрения, так как выделение микоплазм на питательных средах однозначно свидетельствует о присутствии их в организме.

Широкое распространение в диагностике микоплазмоза приобрела пропись состава питательной среды, разработанная институтом им. Н.Ф. Гамалеи г. Москва (1987), которая состоит из питательной основы, представленной гидролизатом сердца крупного рогатого скота, дополнительно содержит глюкозу и эритрит, в качестве стимуляторов роста — экстракт кормовых дрожжей и тиаминобромид, аргинин, цистин, натрий углекислый, а также антибиотик пенициллин. Данная среда отвечает всем требованиям для активного роста микоплазм, чувствительна и селективна в отношении этого микроорганизма, поэтому она может являться контрольной при испытаниях новых питательных сред и изучении их свойств. Харьковский МИИД в 1988 году получил патент на изобретение питательной среды для выделения уреаплазм, отличающуюся от аналога (среда для выделения уреаплазм института им. Н.Ф. Гамалея) тем, что с целью упрощения состава среды она дополнительно содержит гидролизах казеина, в качестве питательной основы — плацентарный бульон, а т акже индикатор -феноловый красный. В 2000 году Махачкалинскими исследователями Э.М. Ахмедовой и М.М. Меджидовым, С.М.А. Омаровым GI.IIIH испытаны новые сухие питательные среды для индикации уреаплазм, с целью повышения чувствительности, в основу которых входил питательный бульон из гидролизата кильки (СПБ) и витаминный препарат «ЭКД».

Среда института им. Н.Ф. Гамалеи для выделения микоплазм также успешно применялась и в ветеринарной практике, о чем свидетельствуют- работы Я.Р. Коваленко (1977); П.М. Митрофанова (1982); Н Н. Шкиля (2000). К другим, из наиболее часто используемых сред относятся: среда ВИЭВ и УНИИЭВ при выделении микоплазм от свиней: П.И. Притулин и др., (1977); А.Я. Пустовар (1978); В.П. Бердник(1986).

Российские ученые для выделения микоплазм используют прописи отечественных сред, однако по имеющимся литературным данным существуют импортные стандартные среды; так, ис-ледователями из Монте-Карло в 1995 году F. Vazquez, F. Carretio, A.F. Perez, M.M. Cuesta, M.L. Ordonez, V. Palacio, было проведено сравнение двух коммерческих методов индикации Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum с использованием агаровой А7 (BioMerieux, France) и двух жидких питательных сред Mycoplasma 1ST (BioMerieux, France) и Мусо Fast ALL-IN (Unipath, U.K.). В результате проведенного опыта был сделан вывод, что среда Mycoplasma 1ST чувствительней, чем Мусо Fast ALL-IN при изоляции из биоматериала Mycoplasma hominis, но в то же время оба метода имеют ограничения при выделении Ureaplasma urealyticum, которые компенсируются при добавлении агаровой среды А7.

Сопоставляя полученные данные литературы мы видим, что в настоящее время начинают появляться новые разработки специальных питательных сред для выделения микоплазм и уреаплазм. Неизученным остается вопрос о сравнении различных питательных сред для индикации микоплазм из организма животных и человека но основным показателям (чувствительность, скорость роста, ингибирующая способность) и составу их основных компонентов (питательная основа, дрожжевой экстракт, сыворотка крови и обогащающие добавки). Также не созданы универсальные стандартные серийно-вынускаемые с отработанной технологической основой производства среды, которые бы обеспечивали рост всех микоплазм, включая и уреаплазм.

Источник

Питательные среды для выделения, культивирования и идентификации микоплазм