Культивирование вирусов в питательных средах
Культивирование вирусов представляет собой их выращивание в искусственных условиях. Для этого культиваторы заражают животных, либо ткани и клетки. Такое мероприятие проводят в целях диагностики, при проведении экспериментов, с целью изготовления противовирусных вакцин.
Культивирование вируса впервые было совершено Гальтье в 1879 году. Он культивировал вирус бешенства, заразив мозг кролика вирусом бешенства, полученным у больной собаки. Ученым Левенштейном была обнародована информация о возможности передачи вируса герпеса от человека кролику.
Репродуцирование вирусом осуществляется исключительно в живых клетках. По этой причине для того, чтобы они накопились, их заражают вирусами. После заражения вирус адаптируется к новому организму. Адаптация вируса проходит тем легче, чем ближе новая среда.
Чтобы репродукция прошла на лучшем уровне используют чувствительную систему, а заражение проводят свежим, но разведенным материалом. Это объясняется тем, что инактивированный вирус может приостанавливать скорость размножения вирионов. Система, в которой осуществляется репродукция, называется пермиссивной. Но, однако для каждого вируса пермиссивная система может приобрести статус непермиссивной. Это будет возможно в случае изменения условий культивирования. К примеру, таким условием являются температурные скачки.
Культивирование вируса на животных осуществляется только в том случае, ели эти вирусы приводят к формированию ясной и понятной клинической картины, либо патологоанатомической картины. Например, во время заражения мышей вирусом бешенства у них случается паралич. Большое количество вирусов хорошо вырастают в птичьих эмбрионах либо теле новорожденных млекопитающих. Реже в организме половозрелых особей.
Культивируют вирус в организмах мышей, крыс, кроликов, кур. На взрослых особях мышей выращивают вирусы гриппа и бешенства.
На белых крысах и хомяках испытывают онкогенные вирусы. Вирус ящура и маргбурской болезни культивируют на морских свинках. Ученые смогли изучить вирусы полиомиелита и желтой лихорадки только после того, как изучили их рост на макаках.
Возбудителей некоторых инфекций ученые смогли определить только после заражения шимпанзе. К таковым относят вирусы гепатита А и В.
Чтобы ученые получили верные результаты все животные, в организме которых культивируют вирусы, должны быть генетически однородными. Для достижения этой цели осуществляют скрещивание лабораторных особей. Результатом такого действия становится растущая степень гомозиготности.
Чтобы культивирование прошло успешно, мало выбора правильного вида и возраста животного. Очень важно, какой будет использован путь для введения материала. Чаще всего вирусы вводят в чувствительные ткани. Лишь малая часть вирусов патогенна для животных независимо от способов введения.
Большая часть нейротропных вирусов выращивают путем введения их в левое и правое полушарие головного мозга животных. Так происходит дело с культивированием вируса у мышей. Кроликам, мышам, овцам, собакам и другим животным аналогичным образом вводят вирус бешенства. Очень часто для культивирования вирусов использую и другой путь: через брюшную полость. Но по чувствительности такой способ уступает введению в головной мозг. Респираторные вирусы чаще вводят в организм интраназальным путем, то есть закапывают в нос или распыляют в виде аэрозоля.
На сирийских хомячках культивируют аденовирус. Вводят его под кожу или в слизистую. В мышцу, через рот, в вену и через анальное отверстие вирусы вводят изредка. Внутривенное заражение произвести с грызунами и другими маленькими животными очень сложно. Вместо этого вирусы вводят прямо в сердечную мышцу.
Осложняется культивирование вирусов в организме животных наличием внутри иных вирусов и бактерий. Иногда случается такое, что вирус в организме животного вырабатывает иммунитет к новому культивируемому.
Чтобы снизить вероятность загрязнения культивируемых вирусов для введения материала используют выращенных в изоляции животных. Для этого выбирают животных, у матерей которых нет в организме инфекций, передающихся от матери к плоду. Новорожденных детенышей извлекают из тела матери, вводят в кишечник специальные молочнокислые бактерии. Для вскармливания таких малышей необходимы SPF самки. Затем уже между такими животными размножение осуществляется тем же путем. Содержатся малыши в закрытых помещениях, в которых осуществляется подача воздуха, свежей пищи и воды.
Животные, в организме которых не имеется никаких возбудителей, содержатся в специально отведенных боксах, в строгой изоляции.
Для культивирования вирусов подходят эмбрионы птиц. Для того, чтобы получить нужные результаты, необходимо правильно выбрать особь, ее вид и возраст, путь заражения и дозу. Температура инкубации играет также немаловажную роль. Из эмбрионов птиц чаще всего используют кур. Их организм до 13 дня отличается повышенной чувствительностью. Хорошо размножаются вирусы в желточном мешке, трахее и легких.
Независимо от пути заражения эмбрионы могут быть травмированы. По этой причине гибель эмбрионов в течение суток после заражения вирусов, ученые не расценивают, как особенную. Обычно для размножения вируса в эмбрионе необходима температура от 36 до 37 градусов. Но для некоторых вирусных клеток необходима температура 40 градусов и выше.
Размножаясь в организме эмбрионов вирусы могут приводить к гибели первых. Большую часть известных науке вирусов выращивают не только в организмах животных, но и в культурах клеток и тканей. В большинстве случаев для этих целей используют клеточные культуры на стекле. Суспензионные культуры используют очень редко. Адаптация вируса проходит легче к первичным культурам клеток, нежели к прививаемым. Для размножения человеческих вирусов лучше всего подходят клетки человека или почечные клетки обезьян.
Доза для вируса при заражении должна составлять от 0,1 до 0,001 пятидесяти процентов тканевой цитопатической дозы вируса на клетку. При это объем вводимого материала должен быть невелик. Через пару часов адсорбируют вирус, только после этого в случае токсичности инокулят удаляют.
При размножении большинства вирусов наблюдаются цитопатические изменения. При дегенерации ¾ клеток в культуре наблюдают максимальное содержание вируса. Размножение вирусов, которые не обладают таким свойством, можно установить при помощи реакции гемадсорбции, путем проведения опытов на животных.
Большая часть вирусных клеток после размножения выходят в культуральную среду, другие же так и остаются связаны с клетками. Некоторые герпетические вирусы пересевают наравне с неповрежденными клетками. Это обусловлено тем, что при разрушении последних осуществляется их инактивация. В некоторых случаях взаимодействие вируса и клетки приводит к развитию хронической болезни.
Чтобы вырастить коронавирус человека, а также другие вирусы берут тканевые культуры. Чаще всего для этих целей используют ткани трахеи кролика. Понять о том, что вирус размножается можно по прекращению движения ресничек культуры ткани.
Нельзя забывать о том, что в культурах клеток и тканей могут быть вирусы и микоплазмы. Попасть туда они могут различным способом.
Для того, чтобы произошла адаптация вируса в искусственно созданных условиях, необходимо проведение нескольких пассажей. Чаще всего они последовательны при введении небольшого количества материала. Во время такой процедуры интенсивность культивирования вируса только растет. Адаптировавшись к одной системе, вирусы часто приобретают возможность размножаться в других системах. Те вирусы, которые выделены недавно, обладают повышенной пластичностью, нежели те, которые долго культивировались в других условиях.
Следствием культивирования вируса в искусственных условиях становится уменьшение их патогенности для естественных владельцев. Такое их свойство положено в основу вакцинации. Если условия культивирования неблагоприятны, то в результате процесса могут появляться дефектные вирусные частицы. В них может содержаться лишь некоторая часть генома. Существуют вирусы, которые в искусственной среде культивировать и вовсе нельзя. После нескольких пассажей их репродукция прекращается.
Вирусы сохраняют в особых условиях. Температура среды не должна быть меньше 4 градусов, а кислотность должна быть равна 7.0. При низкой температуре -70 и ниже вирусы сохраняются отлично. Для этого их помещают в плотно закрытые сосуды. При таких условиях хранения многие из них могут живут годами.
Вирус оспы и энтеровирус хорошо хранится при температуре -20 градусов. Замораживают их быстро. Для их сохранения к среде добавляют стабилизаторы, которые на каждый вирус действуют неоднозначно.
После лиофилизации вирусы могут жить на протяжении длительного промежутка времени. Стабилизаторы, которые применяют: молоко, пептон или куриный желток. Сохранение лиофилизированного вируса должно осуществляться в вакууме или нейтральном газе.
Источник
Среды для выращивания вирусов
Развитие специфической профилактики инфекционных заболеваний человека и животных создало необходимость разработки методов массового получения вирусного сырья.
В течение многих лет заражение животных оставалось единственным методом культивирования вирусов, что служило серьезным препятствием для получения высококачественных вирусных вакцин и в достаточном количестве. До сих пор не удалось культивировать in vitro некоторые вирусы (папилломы человека и др.).
Использование куриных эмбрионов — важный шаг на пути разработки вирусных вакцин. В силу высокой производительности и отличного накопления некоторых вирусов этот метод не потерял своей актуальности. Его и сейчас с успехом применяют для изготовления вакцин против ряда заболеваний человека и животных.
Большое накопление некоторых вирусов в организме составляет серьезную конкуренцию методам их размножения в клеточных культурах. Это, прежде всего, относится к вирусу гепатита В, который накапливается в плазме крови человека в высоком титре (1012—1013 частиц/мл) и является прекрасным источником вирусного антигена для приготовления инактивированной вакцины.
Другим примером может служить вирус миелобластоза птиц, который при экспериментальном заражении цыплят накапливается в плазме крови в титре 5х10 12 вирусных частиц/мл и является хорошим источником препаративного получения ре-вертазы.
Значительные успехи в области выращивания вирусов животных вне организма прежде всего связаны с открытием возможности выращивания полиовируса в экстраневральных тканях (Эндерс и сотр., 1949) и усовершенствованием метода тканевых культур (Дульбекко и др., 1952). Этому в огромной степени способствовало также открытие антибиотиков и создание синтетических и полусинтетических питательных сред. Указанные достижения обеспечили возможность обновить методы получения ранее существовавших препаратов и создать новые эффективные вакцины против ряда вирусных болезней.
В производстве вирусных препаратов широкое применение нашли первичные культуры и линии клеток. Для приготовления живых и инактивированных вакцин человека, а также животных, часто используют вирус, выращенный в первичных культурах клеток животных. В последнее время инактивированные вакцины, предназначенные для вакцинации людей, все чаще готовят с использованием клеточных линий. Для некоторых вакцин, применяемых в животноводческой практике, вирус выращивают в культурах постоянных клеточных линий. Перспектива использования постоянных линий клеток особенно заманчива в плане крупномасштабного суспензионного культивирования.
Выбор метода получения вирусного сырья в каждом конкретном случае определяется специфическими требованиями, предъявляемыми к готовому препарату.
Получение большого количества вирусного сырья с выраженной антигенной активностью особенно необходимо для инактивированных вакцин. Изготовление некоторых из них, применяемых в животноводческой практике, достигло огромных масштабов. С точки зрения технологии крупномасштабного производства вирусных препаратов, метод культивирования вируса должен основываться на потреблении доступных, недорогих, максимально стандартизированных клеточных субстратов и питательных сред, обеспечивать достаточное накопление вируса или вирусного антигена и иметь высокую производительность.
В настоящее время разработаны и широко применяются методы производственного выращивания ряда вирусов человека и животных с целью изготовления вирусных препаратов. Однако, учитывая исключительную практическую важность исследований и разработок в этой области, они постоянно направлены на поиски новых принципов и технологических решений.
Источник
Культивирование вирусов — особенности, способы и интересные факты
21-й век — это век, совершающий семимильные шаги в области технологического прогресса, стремительно развиваются наука и медицина. Современный уровень прогресса позволяет претворить в жизнь то, что раньше казалось человеку невозможным. Постиндустриальная стадия развития человечества нацелена на высокие технологии, инновации во всех сферах.
Особенно быстро развивается медицина: большинство болезней, считавшихся ранее неизлечимыми, теперь таковыми не являются. Так, например, культивирование вирусов позволяет создавать профилактические препараты: вакцины и сыворотки, предотвращающие эпидемии чумы, оспы и других смертельно опасных болезней.
Что такое культивирование?
Культивирование (от лат. cultivo – возделывать) представляет собой процесс разведения и выращивания чего-либо в искусственных условиях. В медицине, а точнее в эпизоотологии – частном ответвлении от ветеринарной медицины, культивирование является основным процессом, позволяющим изучать воздействие вируса на живой организм.
На основании полученной информации фармацевты изготавливают противовирусные препараты, создают методики, позволяющие в будущем противодействовать выявленным микроорганизмам. Выделение вирусов из зараженного материала также позволяет сохранять их для дальнейшего использования.
История эпизоотологии
Еще в 1879 году французский ученый В. Гальтье впервые предпринял попытку культивировать вирус. Его выбор пал на такое заболевание, как бешенство: он выделил неклеточный агент этой болезни посредством заражения кролика кровью больной собаки.
В 1919 году у немца А. Левенштейна получилось заразить вирусом герпеса, взятым у человека, кролика. Годом позже его соотечественник В. Грютер подтвердил опыт своего коллеги и доказал, что подобная культивация на кроликах возможна.
В 1925 году двое ученых – Ф. Паркер и Б. Най – доказали, что вирус коровьей оспы в состоянии воспроизводиться в тканях организма животных. 6-ю годами позже Вудрафф и Э. Гудпасчер заявили, что культивация вируса оспы птиц может проводиться на оболочке куриных эмбрионов, тем самым открыв научному миру новый метод репродукции вирусов.
Процесс заражения клетки
Процесс культивирования вируса невозможен без наличия реагирующей на него клетки. Когда клетка найдена (это могут быть клетки куриных эмбрионов, части тканей, органов или даже целые животные), в нее вводится нуклеиновая кислота вируса, которая перепрограммирует генетическую информацию искомой клетки, заменяя ее своей. Обычно вредоносной частице удается поселиться в клетке, даже несмотря на систему противовирусной защиты и вырабатываемые организмом интерфероны.
После того как вирус проник через мембрану клетки, он начинает размножаться, проходя через 3 стадии. Сначала происходит транскрипция генома закрепившегося вируса, что означает перенос информации из системы ДНК в РНК, которая в последующем синтезируется в ускоренном темпе. Следующий этап – образование и созревание белков, которые послужат каркасом для дочерних вирусных тел.
На последней, заключительной стадии новосинтезированные вирусные тела увеличиваются в количестве. Когда их становится слишком много, разрывают мембрану и выходят из клетки, в которой изначально закрепился вирус. Стоит отметить, что образование вирионов (дочерних тел данного микроорганизма) не всегда приводит к гибели клетки-хозяина. Некоторые способны отпочковываться от мембраны, не вызывая ее разрыва, в то время как клетка продолжает производить вирусные тела.
Микробиология и ее методы
С течением времени биология, как наука, развивалась и впитывала в себя новые факты. Постепенно усложняясь, от нее стали отпочковываться разные направления: биомеханика, гидробиология, вирусология, космическая биология и многие другие. Такой раздел, как микробиология, изучает процессы жизнедеятельности микроорганизмов, в том числе и посредством заражения подопытного лабораторного животного вирусом. Таким образом, в микробиологии культивирование вирусов считается одним из основных способов получения информации, являясь ключевым инструментом биологического метода исследования.
Помимо биологического метода, суть которого заключается в исследовании действия вируса на организм животного и последующей его культивации, существуют и некоторые другие. Во многих случаях вредоносными микроорганизмами заражают куриные эмбрионы, поскольку довольно крупная доля вирусов, известных на сегодняшний день науке, способна реплицироваться именно в этой форме жизни. Однако чаще всего биологи в качестве рабочего материала используют тканевые культуры, поскольку они наиболее продуктивны в качестве метода культивирования.
Вирус и тканевые культуры
Тканевая культура представляет собой некую систему клеток в виде суспензии. Это слой определенного размера, обычно в одну клетку, который помещается на стекло сосуда. Чаще других используется первичная монослойная ткань. Добиться монослойности довольно трудно, сначала выбранную ткань (обычно это ткань сердца, плаценты или почек животных) нужно измельчить.
После измельчения биологи применяют расщепляющий белок фермент – трипсин, который разъединяет клетки ткани, уничтожая между ними межклеточную связь. После достижения разъединения клеток необходимо отмыть их от фермента и поместить в питательную среду, чтобы обеспечить рост получившейся клеточной культуры. Данной средой может послужить среда 199, которая характерна высоким содержанием глюкозы, солей и разных витаминов. Меняется питательная среда по прошествии 2–3 дней.
Кроме первичной ткани для культивирования вирусов также применяются так называемые перевариваемые ткани, которые, в свою очередь, делятся на нормальные и опухолевые. Они более стойкие, чем первичные, и способны длительно размножаться. Нормальными тканями могут послужить органы животных: почки барана, сердце обезьяны. В качестве опухолевых тканей обычно берут клетки HeLa, выделенные изначально из рака шейки матки, или клетки Hep-3, взятые из рака лимфы.
Вирус и куриные эмбрионы
Большинство известных науке вирусов можно выращивать в куриных эмбрионах. Они очень жизнеспособны и устойчивы к негативным внешним воздействиям. Срок, на котором заражается эмбрион, зависит от задач исследования и вида вируса, но обычно не превышает двух недель. Так, например, чтобы провести культивирование вируса гриппа, нужен 9-10-дневный эмбрион, а для того чтобы вырастить вирус паротита, достаточно и недельного эмбриона.
При работе с куриным эмбрионом все его зачатки тканей подвергаются заражению. Результативность культивации можно увидеть на финальной стадии: это может быть гибель эмбриона, а также дефекты развития в виде появления на оболочках эмбриона бляшек, состоящих из вирусных частиц – вирионов.
В любом случае данный метод культивирования и индикации вирусов имеет существенный недостаток, заключающийся в необходимости вскрытия эмбриона для захвата воспроизведенного вируса. Также полученная субстанция имеет в себе высокую концентрацию белка, который нужно удалить, чтобы вывести чистый инфекционный агент для дальнейшего производства медикаментов.
Вирус и организмы животных
В настоящее время использование лабораторных животных в качестве биологического материала в силу своей негуманности ограничено с 1986 года Европейской конвенцией о защите позвоночных животных. Несмотря на это, многие виды животных: мыши и крысы, хорьки и кролики, овцы, собаки и обезьяны – все равно используются в лабораторных работах и экспериментах, поскольку некоторые вирусы способы к репликации только в живых организмах.
Культивирование вирусов в организме животных проводится по-разному: для воспроизведения нейротропных вирусов (бешенство, энцефалит) заражается мозг животного, для создания респираторных (грипп) производится интраназальное заражение, для дерматотропных (оспа) – накожное и подкожное инфицирование.
Чаще прочих для культивации используются грызуны: мыши и крысы, сирийские хомячки, свинки. Их заражают нейротропными инфекционными агентами, аденовирусами, лимфоцитарным хориоменингитом посредством введения вредоносного микроорганизма в мозг или брюшную полость.
Некоторые вредоносные микроорганизмы гораздо быстрее развиваются в телах молодых особей, поэтому онкогенными вирусами заражаются в основном новорожденные крысы и сирийские хомячки. Без них также невозможно обойтись при культивации вирусов Коксаки. Стоит отметить, что биологический метод культивирования вирусов в микробиологии тоже имеет свои изъяны. Во-первых, организмы лабораторных животных загрязняются вирусами, в силу чего они испытывают недомогание. Во-вторых, чтобы получить чистый инфекционный агент, нужно провести его через другие культуры клеток, что увеличивает продолжительность исследования.
Показатели успеха заражения
Культивирование и индикация вирусов – два неразрывных процесса. Индикация позволяет понять, смог ли микроорганизм ужиться в зараженной клетке и получилось ли у него развиваться дальше. Говорить о факте репликации можно, если у животного наблюдаются основные признаки заболевания, а также если органы и ткани подверглись патоморфологическим изменениям. Часто в качестве индикации используется реакция гемагглютинации, которая показывает степень распространения вируса на основе выделяемого им белка гемагглютинина.
Современные особенности культивирования вирусов
Прогресс не стоит на месте, во всех научных сферах появляются инновационные методы, технологии. Микробиология и вирусология не являются исключением. Теперь вместо простого размещения клеточной культуры на сосудах применяется роллерный метод, при котором используемый материал находится на нескольких цилиндрических поверхностях, вращающихся по окружности и периодически омываемых питательной средой. Данный метод хорош тем, что он увеличивает число получаемых клеток и требует меньший расход питательного материала.
Общий вывод
Культивировать вирусы, то есть создавать их в искусственных средах, человек начал совсем недавно. Поначалу заражались организмы животных с целью изучения принципа действия инфекционных агентов и выработки препаратов против них. Благодаря микробиологии, вирусологии и эпизоотологии человечество избавилось от таких смертельной опасности таких заболеваний, как чума, туберкулез, бешенство, корь.
Сейчас для культивации вирусов в основном используются отдельные тканевые культуры и куриные эмбрионы. Посредством различных манипуляций живые клетки заражаются, в них происходит созревание вирусных тел, которые потом выходят за клеточное пространство. Созревшие вирусы собираются биологами для дальнейшего изучения.
Источник