Устойчивость микобактерий туберкулеза во внешней среде
Туберкулез — это острая или хроническая инфекционная болезнь, которая вызывается микобактерией. Как правило, туберкулез поражает легкие (старое название туберкулеза легких — чахо́тка (от слова чахнуть), но в редких случаях может затрагивать другие части тела, например лимфатические узлы, костную систему и головной мозг.
Как происходит заражение туберкулезом? Основным источником распространения инфекции является больной туберкулезом человек, реже крупнорогатый скот, верблюды, свиньи, птицы, другие животные.
Пути передачи от уже болеющего человека:
• воздушно — капельный (с капельками мокроты при кашле, чихании, разговоре);
• воздушно-пылевой (в высохших частицах мокроты, они сохраняют жизнеспособность в течение нескольких месяцев, легко переносят низкие и высокие температуры, высушивание);
• контактно-бытовой путь (при пользовании общей с больным посудой, зубной щеткой, полотенцем, постельным бельем);
• алиментарный (через пищеварительный тракт с инфицированной пищей).
Микобактерий туберкулеза обладают значительной устойчивостью во внешней среде.
- при нагревании до 60°С микобактерий погибают через 30 мин, до 70°С — через 20 мин, а при 80°С — через 5 мин;
- ипячение убивает ее через нескольких минут;
- сухой горячий воздух при 100°С действует на микобактерий менее активно и убивает их только через 1 час;
- в высохшей капле мокроты больного микобактерий могут сохраняться до 10 мес (а в той же капле, находящейся в темноте, они сохраняют свою жизнеспособность от 1 года до 3 лет);
- губительно действует солнечный свет (бактерии погибают через несколько часов.
К низким температурам микобактерии туберкулеза малочувствительны
- при температуре -6°С, -10°С они сохраняют жизнеспособность в течение нескольких недель;
- при температуре -23°С — до 7 лет.
Высокая устойчивость и ряде дезинфицирующих средств
- жизнеспособными в 5-10% растворе серной и соляной кислоты в течение 24 суток;
- 3 % раствор сулемы убивает в течение 6-10 ч, 10% раствор лизола — 12 ч, 5% раствор фенола — 24 ч.
Что убивает микобактерии туберкулеза
- хлорсодержащие препараты (инструкция)
- хлорирование воды, зараженной микобактериями туберкулеза, 100% бактерицидный эффект достигается дозой 8 мг/л при контакте в течение 1 ч) Все вышесказанное необходимо учитывать при организации текущей и заключительной дезинфекции в бытовых очагах туберкулеза и при организации санитарно-эпидемических мероприятий в ПТУ.
Источник
Лабораторные методы выявления микобактерий туберкулеза Методы обследования на МБТ
Бактериологическая диагностика включает обработку клинического материала, микроскопическое исследование, выделение микроорганизма с применением культуральных методов, идентификацию микобактерий с использованием бактериологических и биохимических гестов, а также определение лекарственной чувствительности микобактерий.
Существует несколько групп методов, используемых для выявления МБТ в различном диагностическом материале: рутинные (микроскопия, культуральное исследование), биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ). автоматические системы (MGIT, ВАСТЕС, МВ/ВасТ, ESP Culture System и др.), молекулярной генетические методики (PCR. I.CR, NASBA, Q-Bela и др.). Каждый из этих методов обладает определенной чувствительностью и специфичностью, что необходимо учитывать при клинической интерпретации полученных результатов.
Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену для выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУБ) является наиболее быстрым, доступным и экономически эффективным из существующих методов выявления больных туберкулезом. Оно может быть осуществлено в любой клинико- диагностической лаборатории (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений всех уровней и ведомств. Бактериоскопия мокроты представляется чрезвычайно информативной для выяснения эпидемиологической опасности пациента для окружающих, которая коррелирует с числом микобактерий в образце. Бактериоскопическое исследование, проведенное должным образом, имеет положительную прогностическую ценность для легочного туберкулеза, более 90%. Разрешающая способность данного метода составляет 50-100 тыс. микобактерий в 1 миллилитре мокроты и существенно зависит от ряда факторов: правильности сбора мокроты, подготовленности лабораторного персонала и разрешающей способности используемых микроскопов. При микроскопии мазков, приготовленных из проб, взятых в течение трех последовательных дней, результативность метода повышается на 20-30%. Однако нет необходимости использовать более 4-5 проб мокроты.
Метод окраски по Цилю-Нильсену наиболее часто используется при бакгериоскопичсском выявлении микобактерий. Он заключается в следующем: мазки мокроты окрашивают фуксином при нагревании, затем обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают метиленовым синим. В результате микобактерий окрашиваются в малиновый цвет, а фон — в синий. Это специфическое окрашивание обусловлено способностью микобактерий удерживать краситель при обработке кислотой или спиртом.
В бактериологических лабораториях, выполняющих большое количество исследований (100 и более ежедневно), используется люминесцентная микроскопия. Данный метод основан на способности липидов микобактрий воспринимать люминесцентные красители (акридиновый оранжевый, аурамин, родамин и др.) и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителей, микобактерий туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое — на темно-зеленом фоне. Метод люминесцентной микроскопии обладает большей чувствительностью, чем световая микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), поскольку люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить измененные микобактерий, утратившие кислотоуетойчивость. в связи с чем они не выявляются при бактериоскопии по Цилю-Нильсену. Мазки для люминесцентной микроскопии готовят из осадка, полученного после обработки диагностического материапа детергентом с последующим отмыванием либо нейтрализацией. При положительном результате бактериоскопии мазков, окрашенных флуорохромами, должна быт ь проведена подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену
Источник
«Выявление микобактерий туберкулеза в материале»
Важное эпидемиологическое и клиническое значение имеет обнаружение микобактерий туберкулеза. Для этого используется различный материал, чаще всего мокрота. Лучше исследовать утреннюю мокроту, при незначительном её количестве рекомендуется собирать мокроту в течение суток. Однако немалая часть больных туберкулезом не выделяет мокроту, поэтому в специализированных учреждениях применяется исследование промывных вод трахеи и бронхов, бронхоальвеолярного смыва.
Широкое распространение должен иметь метод раздражающих ингаляций: 10-15% раствором поваренной соли на 2% растворе соды. Его можно применить везде, вплоть до сельского врачебного участка. Исследуются на МБТ также мазки из зева, моча, кал, выпот из полостей, спинномозговая жидкость, выделения из гениталий, отделяемое свищей, материал, полученный при пункциях и биопсиях, а также бронхоальвеолярный смыв (БАС), полученный при бронхоальвеолярном лаваже.
У больных ограниченными формами туберкулеза в БАС находили МБТ в 2,5 раза чаще, чем в мокроте, L-формы МБТ – также чаще. В последнее время доказана возможность выделения микобактерий из крови при выраженных формах туберкулеза, в том числе у детей и подростков. Используется ряд методов выявления микобактерий в материале.
Простая бактериоскопия мазка, окрашенного по Цилю-Нельсену в модификации ВОЗ . Мазок из материала фиксируется на пламени спиртовки или газовой горелки, затем окрашивается карболовым раствором фуксина, после чего обесцвечивается 5% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта, что приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур. Затем производится докрашивание 0,25% раствором метиленового синего. Микобактерии обнаруживаются в виде тонких прямых или слегка изогнутых палочек красного или розового цвета, иногда расположенных в виде римской цифры V.
Нередко в теле бактерии или отдельно обнаруживаются более темные зерна (зернистые формы) и др. формы изменчивости МБТ. В настоящее время при положительном результате бактериоскопии пишут – «обнаружены КУБ (кислотоустойчивые бактерии)», т. к. очень редко, но могут встречаться кислотоустойчивые сапрофиты, обычно в моче. При микроскопии мазка, проводимой в обычном микроскопе под иммерсионным объективом, согласно требованиям ВОЗ, необходим просмотр 100 полей зрения, а в некоторых случаях до 300 в течение не менее 10 минут, что повышает выявляемость и достоверность исследования.
В ряде развивающихся стран этот метод является основным при обследованиях на туберкулез. Однако он недостаточно чувствителен (до 10.000-20.000 микробных тел в 1 мл мокроты). Для повышения чувствительности используют методы флотации (применение суспензии материала с более легким, чем вода, углеводородом для всплывания на поверхность микобактерий и микроскопии флотационного кольца) или седиментации (центрифугирование и микроскопия осадка). Наиболее чувствительным является метод люминесцентной микроскопии, когда мазок окрашивается флюоресцирующими красками и микобактерии выглядят в виде светящихся точек в темном поле.
Большое значение имеет бактериологический метод, когда материал засевают на питательную среду и в случае роста культуры МБТ определяют ее чувствительность к противотуберкулезным препаратам. Обычно используются плотные яично-солевые питательные среды (жидкие и полужидкие применяются редко), т. к. на обычных средах микобактерии не растут. В качестве стандартной используется среда Левенштейна-Йенсена, а также её модификации (Гельберга, Финн-2, Аникина и др.).
В настоящее время в Гродненском медуниверситете изучается эффективность более дешевой плотной питательной среды (Кузнецов О.Е., Гельберг И.С.). При этом возможно выявление МБТ при наличии в 1 мл материала нескольких десятков особей. Изредка при низкой жизнеспособности МБТ в условиях химиотерапии возможно выявление их во время бактериоскопии, обычно люминесцентной, при отсутствии роста на питательной среде.
На плотных питательных средах рост колоний появляется обычно на 3-й – 4-й неделе, однако отрицательный ответ выдается через 3 месяца, ввиду возможности замедленного роста при снижении жизнеспособности МБТ. В настоящее время большое значение придается не только самому факту выявления МБТ при посеве, но и количественной оценке. По рекомендации Центрального НИИ туберкулеза России оценка проводится по 3-м степеням: скудное – от 1 до 20 колониеобразующих единиц (КОЕ) по числу видимых колоний, умеренное – 21-100 КОЕ и обильное – более 100 КОЕ. Величина КОЕ рассчитывается как среднее от числа колоний, выросших во всех пробирках.
Определение лекарственной чувствительности МБТ является неотъемлемой частью бактериологического исследования. Обычно вначале из материала получают рост культуры МБТ, затем их засевают на пробирки со средой, содержащей противотуберкулезные препараты. Устойчивость определяется как снижение чувствительности до такой степени, когда данный штамм микобактерий способен размножаться при концентрации в питательной среде препарата на уровне принятого для него критерия устойчивости (критическая концентрация), например, изониазид – 1 мкг/мл, рифампицин – 40 мкг/мл и т.д.
Определяется также видовая принадлежность МБТ : М. tuberculosis или М. bovis и др. при помощи ниацинового теста. Необходимо также идентифицировать атипичные микобактерии.
К классическим методам идентификации микобактерий относятся:
- изучение цвета колоний (фотохромогенность и др.),
- скорость роста, быстрорастущие относятся к атипичным, чаще сапрофитным группам,
- температура – некоторые атипичные микобактерии, например M. kansasii, M. scrofulaceum могут расти и при комнатной температуре, хотя и медленнее, а M. avium-infracellulare и некоторые другие – при 22°, 37°, но также и при 45°.
Большинство нетуберкулезных микобактерий дают рост в виде S- колоний (гладких), тогда как M. tuberculosis и M. bovis – R-колоний (шероховатых), для них нехарактерно наличие кос, жгутов на жидких средах. Ниациновый тест основан на том, что микобактерии человеческого вида выделяют значительно больше никотиновой кислоты (ниацина) чем остальные – 4-17 мкг/мг, в то время как бычьего – всего 0,3-0,9 мкг/мг. Наличие ниацина выявляется с помощью цветной реакции, в том числе на бумажных полосках.
Тест с определением каталазной активности МБТ основан на том, что при прогревании культуры при 68° 30 мин она теряется у туберкулезных и сохраняется у атипичных микобактерий. При этом следует помнить, что устойчивые к изониазиду МБТ исходно теряют каталазную активность.
К современным методам идентификации относятся молекулярно-генетические методы – пробы ДНК и РНК микобактерий, а также метод хроматографии, значительно ускоряющие исследование. Если ниациновый тест занимает до 6 недель, то Gen Probe на РНК или хроматография – 1 рабочий день. В современных условиях определение видовой принадлежности с помощью молекулярно-биологических методов, выявляющих генетические различия, является наиболее быстрым и занимает 1-2 дня.
В настоящее время появились автоматизированные системы для обнаружения МБТ и определения их лекарственной чувствительности к основным противотуберкулезным препаратам (BACTEC, BBL MG IT MB/Bact System), которые позволяют выявлять рост МБТ и определять чувствительность к противотуберкулезным препаратам в 2-3 раза быстрее классических методов. С этой целью используется радиометрический метод, когда в жидкую питательную среду добавляется меченая 14С пальмитиновая кислота, а выделение микобактериями радиоактивного углерода улавливается специальными датчиками.
Применяется и нерадиологический метод, основанный на поглощении кислорода растущей культурой МБТ. Снижение его концентрации в камере приводит к появлению флюоресценции и свечения в ультрафиолетовых лучах. Реже применяется биологический метод, заключающийся во введении патологического материала морской свинке, высокочувствительной к туберкулезной инфекции.
Современным методом является полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на обнаружении специфической ДНК микобактерий туберкулеза и её фрагментов. Расшифровка последовательностей нуклеотидов ДНК дает возможность их идентифицировать. Суть метода заключается в амплификации (клонировании) определенных специфических локусов ДНК микобактерий и выявлении их при помощи синтетических видоспецифических олигонуклеотидов, называемых праймерами. Такие праймеры в настоящее время синтезированы при помощи компьютерной программы.
Обнаруживаются продукты амплификации путем электрофореза при связывании с праймером. Является наиболее чувствительным из существующих методов и позволяет определять 1-10 микобактериальных клеток в 1 мл материала. Специфичность реакции – 97-98%. При помощи ПЦР можно выявить и лекарственную устойчивость. Если традиционными методами лекарственную чувствительность МБТ удается выявить не ранее чем через 1,5-2 месяца, то применение ПЦР позволяет сделать это за несколько (до 2-3) дней.
В настоящее время установлен ряд генов в ДНК МБТ, мутации которых ответственны за развитие устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. Выявление этих мутаций производится путем разработки и применения молекулярнобиологических методов. Число обнаруженных мутаций в генах все время увеличивается и исчисляется многими десятками.
Для выявления МБТ и ЛУ к рифампицину и изониазиду используется метод биологических микрочипов (ТБ-Биочип-2004), её можно выявить у части больных, где при посеве на обычные среды бактериовыделение не обнаруживается. Методу, несомненно, принадлежит большое будущее. В настоящее время его применение сдерживается дороговизной, а также получаемыми изредка ложноположительными результатами. В настоящее время разработаны методы выявления L-форм микобактерий туберкулеза – бактериоскопические, культуральные с применением селективных питательных сред и др.
Автор: Маханова Нурия
Областной противотуберкулезный диспансер
Источник