Стволовые клетки для выращивания сетчатки

ЭСК для «чайников»

Эмбриональные стволовые клетки

Эмбриональные стволовые клетки и тканевые стволовые клетки – это разные вещи, и это надо хорошо понимать. Тканевые стволовые клетки находятся в очень большом количестве тканей нашего организма. Они отвечают за то, что у нас обновляется кожа, гематопоэтические стволовые клетки находятся в костном мозге, делают кровь. Недавно обнаружили нейрональные стволовые клетки.

Все эти клетки имеют некое общее свойство с эмбриональными стволовыми клетками – все они находятся на некоторой стадии недоразвития. Они недодифференцированы.

Эмбриональные клетки находятся в самом низу этой пирамиды, а тканевые стволовые клетки находятся уже повыше, поэтому их называют «мультипотентными», то есть они имеют потенциал к тому, чтобы превращаться в разные клетки организма обычно в пределах одной ткани. Поэтому их нельзя путать друг с другом. Остальные свойства этих клеток тоже довольно сильно отличаются.

С.Л. Киселев, М.А. Лагарькова. Эмбриональные стволовые клетки человека. Журнал Природа, 2006 г., номер 10

Эмбриональные стволовые клетки получают из 5-дневного эмбриона человека. Другими словами это эмбрион, в котором, на самом деле, находится порядка нескольких сотен клеток. Это бластоциста – такой шарик, заполненный эмбриональными стволовыми клетками. Их можно выделять в культуру, они хорошо растут, они делятся практически бесконечно. В первый раз для человека их выделили более чем 14 лет назад и линии, которые тогда выделили, до сих пор культивируют лаборатории и они не меняют своих свойств. Получается, что мы умеем искусственно поддерживать эти эмбриональные клетки в «подвешенном» состоянии, в состоянии, в котором они находятся в эмбрионе.

Philonenko ES, Shutova MV, Chestkov IV, Lagarkova MA, Kiselev SL. Current progress and potential practical application for human pluripotent stem cells.

У них, в отличие от тканевых стволовых клеток, помимо бессмертности и самовозобновления есть прекрасное свойство – это те клетки, из которых строится весь организм. То есть они могут дифференцироваться в любую взрослую клетку организма. Это свойство называется плюрипотентностью. Это очень важное свойство. Есть тесты на плюрипотентность. Например, мы можем сделать из мышиных клеток собственно мышь, введя их в бластоцисту мыши. То есть можно сделать мышь, полностью созданную из клеток, которые культивируют в лаборатории. Понятно, что мы не можем сделать человека, поэтому единственный тест, аналогичный мышиному, когда мы вводим эти эмбриональные стволовые клетки человека подкожно иммунодефицитной мыши, то есть той, у которой нет иммунного ответа. Часто на месте ввода этих клеток получается тератома – доброкачественная опухоль, она состоит обычно из тканей, принадлежащих к трем зародышевым листкам. Это говорит о том, что in vivo, то есть вживую, а не только in vitro, эмбриональные стволовые клетки человека могут дифференцироваться во все разнообразие тканей. Возможно, именно с этим связаны все страхи по поводу того, что они похожи на раковые клетки, поскольку они могут бесконечно делиться и образовывать тератомы в иммунодефицитных мышах. Но, на самом деле, раковые клетки бывают очень разные. И раковые клетки – это некие сломанные клетки, у которых сломан механизм самоподдержания и превращения во что бы то ни было. У эмбриональных же стволовых клеток, которые растут в культуре, ничего не сломано. Мы их поддерживаем в том состоянии, в котором они находятся в природе, то есть мы их можем контролировать.

Контролем судьбы клеток занимаются тысячи ученых, потому что эта область открывает прекрасные перспективы, когда мы можем взять эмбриональные стволовые клетки и искусственным путем сделать из них сердце, легкое, печень, все что угодно. Во-первых, это очень интересно, поскольку для биологов ЭСК это такое Lego, они могут проходить пути дифференцировки, и с их помощью можно проследить пути развития и пути превращения одной ткани в другую,. Во-вторых, если нам нужно протестировать, как лекарства влияют на эмбриональные клетки или на разные пути развития, мы можем делать это изначально в пробирке, что тоже очень удобно. Плюс мы можем вносить в эти эмбриональные клетки какие-то мутации, например нокауты, то есть выключать какие-то гены, которые важны, например, в эмбриональном развитии, и смотреть что будет. Если мы говорим про эмбриональные стволовые клетки мыши, мы даже можем наблюдать фенотип, то есть то, как проявляется включение тех или иных генов на разных стадиях развития.

Эмбриональные стволовые клетки берут из эмбрионов, которые остались после процедуры ЭКО. Обычно их делают небольшое количество, часть из которого подсаживают, часть нет. Ту часть, которые не подсаживают, с позволения пациентов, родителей, отдают на нужды лаборатории. И в этом нет никакого, на мой взгляд, живодерства, потому что это пятидневные зародыши, это бластоцисты, несколько сотен клеток, в которых нет разделения ни на нервную систему, ни какую бы то ни было. И как мы знаем уже из практики, это неспециализированные клетки, из которых может получиться все, что угодно. Однако может не получиться, поскольку никто не знает, разовьется этот конкретный эмбрион или нет.

International Society for Stem Cell Research (Providing a global forum for stem cell research and regenerative medicine)

Сейчас эмбриональные стволовые клетки в практике, в биомедицине кроме каких-то фундаментальных вещей используются как универсальный поставщик разнообразных тканей. И, учитывая, что мы можем делать более дифференцированные производные и научились их делать в довольно большом количестве, то можно пытаться делать какую-то заместительную тканевую терапию. То есть выращивать некую ткань, которая будет приживаться на месте поврежденной. Сейчас есть несколько клинических испытаний (проводятся на производных эмбриональных стволовых клеток), и одни из самых многообещающих тестов – это тесты на олигодендроцитах, которые получены из эмбриональных стволовых клеток. Эти олигодендроциты, это эмбриональные стволовые клетки, которые запущены в сторону нейронального развития, но это не конечная ветвь. Они еще могут развиваться дальше. Идея теста заключается в том, что когда происходит некая травма нервной системы, когда нейроны восстанавливаются, они не могут восстанавливать миелиновую оболочку вокруг них, а без нее сигналы не проходят. И олигодендроциты – это те клетки, которые создают миелиновые оболочки. Сейчас клинические тесты проводятся всего на 10-20 пациентах, потому, что главный вопрос в этих тестах сейчас состоит в том безопасны или нет эти клетки. Сегодня все еще есть страхи насчет того, что они, попадая в живой организм, будут вести себя непредсказуемо. Сейчас уже сделаны успешные тесты на крысах и на обезьянах. И пациенты, на которых делаются эти тесты, это пациенты довольно строгой группы, у которых были травмы позвоночника, в течение недели до того как эти клетки им подсаживают. Предполагается, что на таких ранних стадиях травматического восстановления как раз эти олигодендроциты помогают пациенту восстановиться и восстановить связи в его спинном мозге. На крысах и на обезьянах это получается.

Еще одна ветвь, по которой идут клинические испытания, это получение клеток пигментного эпителия из эмбриональных стволовых клеток. Пигментный эпителий – это сетчатка глаза и с ней связано очень много болезней как генетических, так и просто старческих. Например, дистрофия сетчатки – истончение сетчатки, когда люди постепенно перестают видеть. Сегодня мы довольно эффективно умеем делать из эмбриональных стволовых клеток клетки пигментного эпителия. Ученые пытаются подсаживать эти клетки пигментного эпителия больным дистрофией сетчатки. Глаз – очень удобная модель для контроля приживаемости трансплантата.

Предварительные тесты показывают, что все идет хорошо, и пациенты буквально прозревают. Но это предварительные исследования. И пока такая практика не ушла не то, что в клинику, но и ни в какие более серьезные группы пациентов. Поэтому пока еще рано говорить о всеобщем клиническом применении этих клеток. Но, тем не менее, уже понятно, что это можно делать. Так и до эры клинического применения стволовых клеток еще очень далеко. Все опыты с производными эмбриональных стволовых клеток затрудняются тем, что все-таки это клетка другого человека. Иммунологически они бывают, так же как и органы трансплантации, несовместимы с пациентом. В этом заключается самая большая проблема трансплантации с использованием производных эмбриональных стволовых клеток.

Автор – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории генетических основ клеточных технологий Института общей генетики РАН.

Источник

Нейронауки в Science и Nature. Выпуск 211: можно ли вылечить слепоту стволовыми клетками?

В журнале Nature вышел обзор последних достижений в области регенеративной офтальмологии — о лечении стволовыми клетками болезней глаз: глаукомы, повреждений роговицы и дегенерации желтого пятна.

Первая в мире роговица, созданная при помощи биопечати и стволовых клеток. Credit: Newcastle University

Большинство клеток в нашем организме специализируются на определенных задачах: эритроциты переносят кислород из легких к тканям и углекислый газ в обратном направлении, клетки желез вырабатывают специфические молекулы и «рассылают» их по кровотоку остальным клеткам, клетки сетчатки улавливают свет и передают в мозг сигналы. Стволовые клетки — «мать всех клеток», клетки-предшественники, способные дифференцироваться, то есть превращаться в специализированные клетки. Именно стволовые клетки ответственны за обновление изношенных клеток нашего организма.

Восстановление роговицы

В норме роговицу окружает лимб — полупрозрачное кольцо, содержащее стволовые клетки. Эти клетки образуют эпителиальный слой, который защищает и поддерживает роговицу. При травме или инфекции запас стволовых клеток истощается, роговица не регенерирует и мутнеет, в результате чего ухудшается зрение. Поврежденную роговицу можно заменить на донорскую, но без стволовых клеток ее со временем постигнет та же участь, что и родную роговицу.

Чтобы решить эту проблему, в Massachusetts Eye and Ear — больнице, которая специализируется на офтальмологии и отоларингологии, — в поврежденный глаз пересадили стволовые клетки. Их брали из здорового глаза и выращивали на образце амниотической мембраны — слое плаценты, который уже давно применяется для ускорения заживления поврежденной роговицы. Когда лист из стволовых клеток достигал нужного размера, его пересаживали в поврежденный глаз. Пациентам с истощенным запасом стволовых клеток, но неповрежденной роговицей такой процедуры оказалось достаточно для восстановления зрения. Другим пациентам, помимо пересадки стволовых клеток, потребовалась трансплантация роговицы от донора.

Регенеративная медицина существует около 25 лет. За это время ученые создавали из стволовых клеток различные ткани, от сетчатки до сердечной мышцы. Однако пересадка стволовых клеток в глаза часто заканчивалась неудачей. Отчасти это было связано с тем, что в глазном яблоке содержится множество различных типов клеток. Поэтому Кодзи Нисида (Kohji Nishida), офтальмолог из Осакского Университета, решил создать органоид глаза — трехмерную структуру, которая растет в лаборатории и имитирует развитие глаза. Из этого органоида можно взять эпителиальный слой, содержащий необходимые стволовые клетки, и перенести его в поврежденный глаз. Нисида уже пересадил такие «пластыри» из стволовых клеток четырем испытуемым. Все трансплантаты прижились, зрение у пациентов улучшилось. Первую фазу клинического испытания ученый планирует завершить к марту 2022 года. Затем он надеется провести исследование в других центрах, а в течение нескольких лет получить разрешение на лечение пациентов этим методом.

Другой исследователь — Че Коннон (Che J.Connon), тканевый инженер из Ньюкаслского университета в Англии, печатает роговицы на биопринтере. Он смешивает стволовые клетки с коллагеном и экстрактом водорослей и формирует биочернила. С помощью 3D-печати эти биочернила наносятся на изогнутую подложку — так создается роговица. Ученый надеется, что через несколько лет такую роговицу можно будет пересаживать людям.

Восстановление сетчатки

У людей старше 60 лет зрение часто ухудшается из-за возрастной дегенерации желтого пятна — области на задней части сетчатки глаза. Этим заболеванием во всем мире страдают почти 200 миллионов человек. Болезнь развивается из-за разрушения пигментного эпителия сетчатки — слоя клеток, который обеспечивает питательными веществами фоторецепторы. К фоторецепторам сетчатки человеческого глаза относятся три типа колбочек, которые отвечают за цветное зрение, и один вид палочек, отвечающий за сумеречное зрение. Разрушение клеток эпителия приводит к гибели фоторецепторов и потере зрения. Клетки пигментного эпителия также могут повреждаться при различных болезнях глаз, например при диабетической ретинопатии.

Попытки пересадить клетки пигментного эпителия, выращенные из стволовых клеток, долгое время заканчивались провалом. К 2013 году хороших результатов удалось достичь, пересаживая клетки не по отдельности, а сплошным слоем. Такого подхода придерживается Капил Бхарти (Kapil Bharti) — клеточный биолог из Национального института глаз в Бетесде, США. Он выращивает клетки пигментного эпителия на биоразлагаемом полимерном каркасе, уже одобренном FDA, и пересаживает их целым листом.

Для производства этих клеток Бхарти использует индуцированные стволовые клетки, полученные из собственных клеток крови пациента. Преимущество такого подхода состоит в том, что можно не использовать иммунодепрессанты, предотвращающие отторжение трансплантата. Бхарти работает вместе с офтальмологом Дэвидом Гаммом (David Gamm), который использует стволовые клетки для выращивания фоторецепторов.

Восстановление ганглионарных клеток

Фоторецепторные клетки с одной стороны прикрепляются к слою пигментного эпителия, а с другой — к биполярным клеткам, которые связываются с ганглионарными клетками сетчатки. Аксоны ганглиозных клеток входят в зрительный нерв и передают сигналы от сетчатки к мозгу.

Петр Баранов (Petr Baranov) возглавил совместное исследование Гарвардской медицинской школы и Московского физико-технического института. Ученые выращивают ганглионарные клетки сетчатки из стволовых клеток и трансплантируют их мышам с уничтоженными собственными ганглионарными клетками. Около 65% пересаженных ганглионарных клеток прижились на срок не менее 12 месяцев. Измерив сигналы, идущие от сетчатки к мозгу, ученые определили, что новые клетки функционируют. Улучшают ли эти трансплантаты зрение, пока неизвестно, исследователи надеются выяснить это в ближайшее время. Пока они пересаживают в один глаз 10–20 тысяч клеток, а чтобы восстановить зрение, по их словам, нужны сотни тысяч клеток.