Раздел «Промышленная биотехнология»
Производство белка микроорганизмов
Субстраты для культивирования микроорганизмов с целью получения белка
В качестве источников вещества и энергии микроорганизмы используют самые разнообразные субстраты — нормальные парафины и дистилляты нефти, природный газ, спирты, растительные гидролизаты и отходы промышленных предприятий.
Для выращивания микроорганизмов с целью получения белка хорошо бы иметь богатый углеродом, но дешевый субстрат. Этому требованию вполне отвечают нормальные (неразветвленные) парафины нефти. Выход биомассы может достигать при их использовании до 100% от массы субстрата. Качество продукта зависит от степени чистоты парафинов. При использовании парафинов достаточной степени очистки, полученная дрожжевая масса может успешно применяться в качестве дополнительного источника белка в рационах животных. Первый в мире крупный завод кормовых дрожжей мощностью 70 000 т. в год. был пущен в 1973 г. в СССР. В качестве сырья на нем использовали выделенные из нефти н-алканы и несколько видов дрожжей, способных к быстрому росту на углеводородах: Candida maltosa, Candida guilliermondii, Candida lipolytica. В дальнейшем именно отходы от переработки нефти служили главным сырьем для производства дрожжевого белка, которое быстро росло и к середине 80-х гг. превысило 1 млн. т. в год, причем в СССР кормового белка получали вдвое больше, чем во всех остальных странах мира, вместе взятых. Однако в последующем масштабы производства дрожжевого белка на углеводородах нефти резко сократились. Это произошло как в результате экономического кризиса 90-х гг., так и из-за целого ряда специфических проблем, с которыми связано это производство. Одна из них — необходимость очистки готового кормового продукта от остатков нефти, имеющих канцерогенные свойства.
В нашей стране мало районов, пригодных для выращивания сои, являющейся основным источником белковых добавок. Поэтому налажено крупнотоннажное производство кормовых дрожжей на n-парафинах. Действует несколько заводов мощностью от 70 до 240 тыс. тонн в год. Сырьем служат жидкие очищенные парафины.
Одним из перспективных источников углерода для культивирования продуцентов белка высокого качества считается метиловый спирт. Его можно получать методом микробного синтеза на таких субстратах, как древесина, солома, городские отходы. Использование метанола в качестве субстрата затруднено из-за его химической структуры: молекула метанола содержит один атом углерода, тогда как синтез большинства органических соединений осуществляется через двухуглеродные молекулы. На метаноле как на единственном источнике углерода и энергии способны расти около 25 видов дрожжей, в том числе Pichia polymorpha, Pichia anomala, Yarrowia lipolytica. Наилучшими продуцентами на этом субстрате считаются бактерии, потому что они могут расти на метаноле с добавлением минеральных солей. Процессы получения белка на метаноле достаточно экономичны. По данным концерна Ай-Си-Ай (Великобритания), себестоимость продукта, производимого на метаноле, на 10-15% ниже, чем при аналогичном производстве, базирующемся на основе высокоочищенных n-парафинов. Высокобелковые продукты из метанола получают фирмы ряда развитых стран мира: Великобритании, Швеции, Германии, США, Италии. Продуцентами белка служат бактерии рода Methylomonas. Выращивание на метаноле метилотрофных бактерий, таких как Methylophilus methylotrophus, выгодно, так как они используют одноуглеродные соединения более эффективно. При росте на метаноле бактерии дают больше биомассы, чем дрожжи. Первая реакция окисления метанола у дрожжей катализируется оксидазой, а у метилотрофных прокариот — дегидрогеназой. Ведутся генно-инженерные работы по переносу гена метанолдегидрогеназы из бактерий в дрожжи. Это позволит объединить технологические преимущества дрожжей с эффективностью роста бактерий.
Использование этанола как субстрата снимает проблему очистки биомассы от аномальных продуктов обмена с нечетным числом углеродных атомов. Стоимость такого производства несколько выше. Биомассу на основе этанола производят в Чехословакии, Испании, Германии, Японии, США.
В США, Японии, Канаде, ФРГ, Великобритании разработаны технологические процессы получения белка на природном газе. Выход биомассы в этом случае может составлять 66% от массы субстрата. В разработанном в Великобритании процессе используется смешанная культура: бактерии Methylomonas, усваивающие метан, Hypomicrobium и Pseudomonas, усваивающие метанол, и два вида неметилотрофных бактерий. Культура характеризуется высокой скоростью роста и продуктивностью. Главные достоинства метана (кстати сказать, основного компонента природного газа) — доступность, относительно низкая стоимость, высокая эффективность преобразования в биомассу метаноокисляющими микроорганизмами, значительное содержание в биомассе белка, сбалансированного по аминокислотному составу. Бактерии, растущие на метане хорошо переносят кислую среду и высокие температуры, в связи с чем устойчивы к инфекциям.
Субстратом для микробного синтеза может быть и минеральный углерод — углекислый газ. Окисленный углерод в данном случае с успехом восстанавливается микроводорослями при помощи солнечной энергии и водородоокисляющими бактериями при помощи водорода. На корм скоту используют суспензию водорослей. Для работы установок по выращиванию водорослей необходимы стабильные климатические условия — постоянные температуры воздуха и интенсивность солнечного света.
Наиболее перспективно получение белка с помощью водородоокисляющих бактерий, которые развиваются за счет окисления водорода кислородом воздуха. Энергия, высвобождающаяся в этом процессе, идет на усвоение углекислого газа. Для получения биомассы используются, как правило, бактерии рода Hydrogenomonas. Первоначально интерес к ним возник при разработке замкнутых систем жизнеобеспечения, а затем их стали изучать с точки зрения использования в качестве продуцентов высококачественного белка. В институте микробиологии Геттингенского университета (Германия) разработан способ культивирования водородоокисляющих бактерий, при котором можно получать 20 г сухого вещества на 1 литр суспензии клеток. Возможно, в будущем эти бактерии станут основным источником пищевых микробных белков.
Исключительно доступным и достаточно дешевым источником углеводов для производства микробного белка является растительная биомасса. Любое растение содержит разнообразные сахара. Целлюлоза — полисахарид, состоящий из молекул глюкозы. Гемицеллюлоза состоит из остатков арабинозы, галактозы, маннозы, фруктозы. Проблема в том, что полисахариды древесины связаны жесткими оксифенилпропановыми звеньями лигнина — полимера, почти не поддающегося разрушению. Поэтому гидролиз древесины происходит только в присутствии катализатора — минеральной кислоты и при высоких температурах. При этом образуются моносахара — гексозы и пентозы. На жидкой, содержащей сахара, фракции гидролизата выращивают дрожжи. При кислотном гидролизе древесины образуется ряд побочных продуктов (фурфурол, меланины), а из-за высоких температур может произойти карамелизация сахаров. Эти вещества препятствуют нормальному росту дрожжей, их отделяют от гидролизата и по возможности используют. В качестве продуцентов используют штаммы Candida scotti и C.tropicalis.
Наиболее крупным производителем сырья для гидролизной промышленности являются деревообрабатывающие предприятия, отходы которых достигают ежегодно десятки миллионов тонн. К сожалению, нерационально или не используются вообще отходы производства лубяных волокон (из льна и конопли), картофелекрахмального производства, пивоваренной, плодоовощной, консервной промышленности, свекловичный жом.
Особого внимания заслуживают способы прямой биоконверсии продуктов фотосинтеза и их производных в белок с помощью грибов. Эти организмы благодаря наличию мощных ферментных систем способны утилизировать сложные растительные субстраты без предварительной обработки. Исследования условий биоконверсии растительных субстратов в микробный белок активно ведутся в США, Канаде, Индии, Финляндии, Швеции, Великобритании, в нашей стране и других странах мира. Однако в литературе сведения о широкомасштабном производстве белков микробного происхождения немногочисленны. Наиболее известным и доведенным до стадии промышленной реализации является процесс «Ватерлоо», разработанный в университете Ватерлоо в Канаде. Это процесс, основанный на выращивании целлюлозоразрушающих грибов Chaetomium cellulolyticum, можно осуществлять как в глубинной культуре, так и поверхностным методом. Содержание белка в конечном продукте (высушенном грибном мицелии) составляет 45%. Финская фирма «Тампелла» разработала технологию и организовала производство белкового кормового продукта «Пекило» на отходах целлюлозно-бумажного производства. Продукт содержит до 60% протеина с хорошим аминокислотным профилем и значительное количество витаминов группы В.
В большинстве стран — производителей молока традиционным способом утилизации сыворотки является скармливание её животным. Степень конверсии белка сыворотки в белок животного весьма невысока (для выработки 1 кг животного белка необходимо 1700 кг сыворотки). В последние 10-15 лет из сыворотки методом ультрафильтрации выделяют белки высокого качества, на основе которых делают заменители сухого обезжиренного молока и другие продукты. Концентраты можно использовать как пищевые добавки и компоненты детского питания. Из сыворотки производится и молочный сахар — лактоза, применяемая в пищевой и медицинской промышленности. При всем при этом объем промышленной переработки сыворотки составляет 50-60% от её общего производства. Следовательно, налицо большие потери ценнейшего молочного белка и лактозы. Более того, возникает проблема утилизации отходов, так как процесс естественного разложения сыворотки происходит крайне медленно. Лактоза молочной сыворотки может служить источником энергии для многих видов микроорганизмов, сырьем для производства продуктов микробного синтеза (органических кислот, ферментов, спиртов, витаминов) и белковой биомассы. Из всех известных микроорганизмов самым высоким коэффициентом конверсии белка сыворотки в микробный белок обладают дрожжи. Способность к ассимиляции лактозы имеется примерно у 20% всех известных видов дрожжей. Гораздо реже встречаются дрожжи, сбраживающие лактозу. Активный катаболизм лактозы особенно характерен для дрожжей из рода Kluyveromyces. Эти дрожжи можно использовать для получения на молочной сыворотке кормового белка, этанола, препаратов β-глюкозидазы.
Впервые дрожжи на молочной сыворотке стали выращивать в Германии. В качестве продуцентов применяли различные штаммы сахаромицетов. Разработаны способы получения микробных продуктов, основанные на использовании лактозы как монокультурой, так и смесью дрожжей и бактерий. В настоящее время в качестве продуцентов используют дрожжи родов Candida, Trichosporon, Torulopsis. Молочная сыворотка с выросшими в ней дрожжами по биологической ценности значительно превосходит исходное сырье и её можно использовать в качестве заменителя молока. Приведенный перечень микроорганизмов и процессов получения белка одноклеточных не является исчерпывающим. Однако потенциал этой новой отрасли производства используется далеко не полностью. Кроме того, мы еще не знаем всех возможностей деятельности микроорганизмов в качестве продуцентов белка, но по мере углубления наших знаний, они будут расширены.
Источник
Питательные среды, используемые для выращивания микроорганизмов, их общая характеристика и компонентный состав
Питательные среды, используемые для выращивания микроорганизмов, их общая характеристика и компонентный состав.
Микроорганизмам для нормального роста, развития и размножения необходим комплекс питательных, веществ, позволяющий поддерживать в рабочем состоянии все структурные компоненты и функциональную активность микробной клетки. Поэтому в микробиологии в целом и биотехнологии в частности успехи в культивировании микроорганизмов в значительной степени определяются знанием их физиолого-биохимических особенностей и подбором питательных сред.
Питательные среды применяют при выращивании микроорганизмов и выделении их в чистой культуре, при получении биотехнологическими методами различных микробных препаратов (антибиотиков, вакцин, аминокислот, биостимуляторов, витаминов и т.д.) и изучении свойств микробов. Состав питательных сред и условия культивирования микроорганизмов в значительной степени определяют результаты микробиологических исследований.
Для построения белков клетки требуется азот, углерод, водород, кислород. Снабжение водородом и кислородом осуществляется за счет воды. Источники углерода многочисленны и многообразны. На первом месте стоят сахара, многоатомные спирты и кислоты. Углерод является также составной частью всех органических соединений, в том числе белков, пептонов, аминокислот. Поэтому в составе питательных сред специальные дополнительные источники углерода не нужны.
Основное внимание следует уделять источникам азота. Все искусственные питательные среды как самостоятельно изготавливаемые в лабораториях, так и» выпускаемые централизованно (сухие питательные среды), имеют в своей основе вещества, содержащие азот. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного происхождения — мясо (преимущественно говяжье), рыба, мясокостная мука, казеин. В ряде случаев используются заменители полноценного мяса — отходы мясомолочной промышленности, плаценту, кровяные сгустки, а также дрожжи и белки растительного происхождения (соевые бобы, горох, ячмень и др.).
Микробам для нормального роста и развития нужны микроэлементы — небольшие количества некоторых металлов (железо, медь, марганец и др.). Микроэлементы участвуют в образовании коферментов, посредством которых сложные вещества подвергаются гидролизу до более простых и растворимых в воде соединений, ассимилируемых микробами. Не-органические вещества — соли, содержащие хлор, фосфор, натрий, калий, кальций, магний и некоторые другие элементы, нужны для построения и нормального функционирования различных структур микробной клетки. Ростовые вещества или «факторы роста», которыми в основном являются витамины группы В, играют важную роль стимуляторов и регуляторов обмена веществ у микробов.
Синтетическим питательными средаминазываются такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. В качестве источника азота обычно используют различные аминокислоты или аммонийные соли.
По консистенциипитательные среды могут быть плотными, жидкими и полужидкими.Плотные среды готовят путем добавления к жидкой основе 1.5-2% агара, полужидкие 0.3-0.4% агара, который представляет собой сложный полисахарид — продукт переработки особого вида морских водорослей, и в застывшем состоянии придает среде плотность. Агар плавится при температуре 80-86°С и затвердевает при температуре около 40°С. В некоторый случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10-15%). Такие естественные среды, как свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок, сами по себе являются плотными.
По целевому назначениипитательные среды делят на основные, элективные и дифференциально-диагностические. К основнымотносятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. По составу принято выделять естественные или натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды, о которых уже говорилось выше. К основным средам, используемым в .микробиологии, относят триптические гидролизаты казеина, рыбных продуктов, мясокостной муки и др., из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления более сложных: сахарных, кровяных, сывороточных и др., удовлетворяющих пищевой потребности более требовательных патогенных бактерий.
Элективные питательные средыпредназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида в местах их естественного обитания из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. Создавая элективные (для определенных микробов) питательные среды, исходят из биологических особенностей, которые, отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококка наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона — в щелочной среде.
Дифференциально-диагностические питательные средыприменяются для разграничения отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что равные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. Компонентами дифференциально-диагностических сред являются: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат (например, лактоза в среде Эндо), различное отношение к которому является диагностическим признаком для микроорганизмов; в цветной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Дифференциально-диагностические среды широко используются в диагностических исследованиях для идентификации бактерий.
Реакция среды.Для роста разных видов микробов требуется определенная реакция среды, которая выражается показателем концентрации водородных ионов (рН). Для большинства бактерий устанавливают рН среды в пределах 6.8-8.0. Ориентировочную реакцию питательной среды можно устанавливать стандартной индикаторной бумагой. Чаще всего для ее изготовления используют индикатор крезоловый красный (диапазон изменения цвета смотри табл.1). Для более точного измерения среды используют рН-метр.
Для успешного роста микробов недостаточно правильно установить первоначальную реакцию питательной среды. Микроорганизмы в процессе роста образуют ряд кислот, что делает реакцию среды кислой и является основной причиной прекращения роста. Во избежание этого необходимо создать условия, препятствующие резкому изменению реакции среды. Отчасти препятствуют изменению рН азотистые вещества, имеющиеся в среде. Чем больше аминокислот в субстрате, тем большими буферными свойствами обладает среда. В настоящее время ко многим питательным смесям прибавляют еще фосфатные буферные смеси.
Индикаторы, меняющие свай цвет при изменении рН среды, используют не только для определения реакции среды. Их вводят также в состав специальных сред, которые служат для выявления биохимических свойств микробов. Изменение цвета среды указывает на образование кислоты или щелочи при ферментативной деятельности микробов. Известны индикаторы, приобретающие ту или иную окраску лишь при щелочной или кислой реакции, вне этой реакции они бесцветны. Так, среда, содержащая индикатор Андредеменяет свою интенсивную красную окраску при значениях рН=5.3-5.5, в случае подщелачивания среды, становится бесцветной — при рН=7.2. Фенолфталеинбесцветен при кислой реакции, а окраску приобретет з диапазоне рН=8.3-10.0.
Более удобны двухцветные индикаторы, имеющие разную окраску в кислой и щелочной среде. Наиболее широко распространены индикаторы Кларка.Они имеют различную окраску в кислой и щелочной среде. В средах, содержащих такие индикаторы, хорошо выражены переходные тона. Кроме того, диапазон чувствительности индикаторов Кларка весьма широк.
Источник