Маленький, но настоящий человеческий орган
До создания волосяного фолликула из пробирки далеко, но прогресс очевиден
В будущем человечество научится выращивать в пробирке не только клетки, но и сложные органы, а то и живые организмы целиком. По крайней мере фантасты в этом уверены. В реальности до этого еще очень далеко.
Фото: SEBASTIAN KAULITZKI / SCIENCE PHOTO LIBRARY / Getty Images
Фото: SEBASTIAN KAULITZKI / SCIENCE PHOTO LIBRARY / Getty Images
Впечатляющие успехи достигнуты в технологиях реконструкции тканей, однако задача вырастить крупный орган остается невыполнимой. А вот с маленькими можно попробовать. Успехи в создании новых биоматериалов, совершенствование технологий выращивания клеток в искусственных средах, управление их программами дифференцировки, развитие технологий трехмерной печати позволяют это сделать. Кроме того, по мере изучения поведения клеток в развитии становится ясно, что при определенных условиях они способны к самоорганизации в структуры формирующихся ткани или органа.
Из клеток, аналогичных клеткам раннего эмбриона человека (так называемых плюрипотентных клеток), возможно получение небольших органоподобных структур (органоидов) или мини-органов, практически полностью воспроизводящих в миниатюре структуры нормальных органов. Такие модели дают бесценную и неисчерпаемую информацию о том, как формируется данный орган, как происходит образование тех или иных клеточных типов, как клетки взаимодействуют друг с другом и что нужно для того, чтобы это все происходило.
Многие механизмы развития воспроизводятся в том случае, когда взрослому организму необходимо восстановление утраченного в результате болезни или травмы. Это называется регенерацией.
Регенерация — сложный процесс, в котором задействовано множество факторов. Иногда надо восстановить целостность ткани (например, костной или мышечной), а иногда — орган целиком. У ящерицы или саламандры получается регенерировать конечность или хвост, у рыб — сердце, а вот человеку до этого далеко: даже поверхностные кожные раны не всегда заживают без следа, не говоря уже о поврежденном сердце или конечности. Однако есть у нас орган, который с определенной периодичностью сам по себе разрушается и вновь регенерирует в течение всей жизни. Это крошечная многоклеточная «машина» по производству шевелюры — спрятанный в глубине кожи волосяной фолликул. У человека стержень растет на протяжении нескольких лет, а затем наступает период разрушения, когда от фолликула остается небольшая группа клеток, замершая в покое. Через несколько месяцев по сигналу, поступающему из окружающих тканей и внутри самого фолликула, «птица феникс» оживает, клетки начинают делиться и выстраивают структуру фолликула, которая обеспечивает наращивание нового стрежня. В состав растущего фолликула входят по крайней мере два типа тканей и 15 типов клеток, в том числе тканеспецифичные (то есть обеспечивающие поддержание ткани данного типа) стволовые клетки. Все они по мере образования обновленного фолликула располагаются друг относительно друга и окружающей кожи в определенном порядке, что гарантирует каждый раз воспроизведение практически идентичной структуры волоса. Правда, с возрастом часть клеток все же погибает или не размножается должным образом. В результате человек седеет, волосы становятся тоньше или вовсе исчезают.
Если же «сон» фолликула затягивается или он погибает по какой-то причине, человек может облысеть и в молодом возрасте. Это во многих случаях психологически дискомфортное состояние. Понять закономерности регенерации волосяного фолликула — не только улучшить жизнь многих людей, но и приблизиться к восстановлению других жизненно важных органов, регенерация которых зависит от сложных взаимодействий между клетками, самосборки, правильного роста и образования новых типов клеток в процессе формирования тканей.
Кстати, стволовые клетки волоса, спрятанные в глубине кожи, становятся ценным источником клеточного материала в случае повреждения кожи: они размножаются, мигрируют наверх и «залатывают» бреши в защитном покрове нашего тела. Кроме того, есть определенные указания на то, что именно участие этих клеток в заживлении ран снижает вероятность формирования грубых рубцов.
В последние годы проделан большой путь в понимании механизмов, по которым клетки фолликула общаются между собой, размножаются и продуцируют составные части стержня волоса. Соответственно, появилась надежда на возможность выращивания волос в лаборатории или стимуляции их роста с помощью химических и биологически активных агентов, а также введения в кожу клеток нужного типа, которые по какой-то причине погибли у пациента. Есть у ученых и более амбициозная идея: попробовать «собрать» зачаток фолликула в пробирке. Включение таких зачатков в тканеинженерные живые аналоги кожи позволит улучшить косметические результаты лечения ран и ожогов, а отдельные зачатки могут быть в будущем использованы для аутологичной (то есть с использованием собственных клеток) трансплантации людям, страдающим от алопеции (облысения).
Пока что наиболее успешно получается выращивать зачатки волос из клеток мыши или очень ранних предшественников клеток кожи человека. Заставить клетки взрослого человека воспроизвести цикл регенерации фолликула в лабораторных условиях довольно трудно. Однако ряд научных экспериментов, проведенных за последние пять-семь лет, демонстрируют определенный прогресс в этом направлении.
В Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН в Москве также ведутся подобные исследования. Мы изучаем возможность самоорганизации зачатка волосяного фолликула человека, комбинируя клетки различных типов и создавая условия для их правильного взаимодействия и размножения. Если в висящую на крышке чашки Петри каплю культуральной среды поместить суспензию клеток, полученную определенным образом из кожи взрослого человека, можно наблюдать образование клеточных агрегатов. В таких агрегатах регистрируется повышение активности генов, ответственных за регенерацию фолликула. Клетки распределяются внутри агрегата определенным образом, а при пересадке таких агрегатов под кожу мышам наблюдается рост структур, напоминающих фолликул. В подобных экспериментах используются также и плюрипотентные клетки. В этом случае мы воспроизводим развитие кожи и комбинируем «молодые» клетки в надежде получить более совершенную структуру фолликула. Однако генетические программы, управляющие получением клеток нужных нам типов, далеко не все известны, поэтому полноценного «волоса из пробирки» придется еще подождать.
Екатерина Воротеляк, доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, заведующая лабораторией клеточной биологии Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН, заведующая отделом регенеративной медицины РНИМУ им. Н.И. Пирогова, профессор кафедры клеточной биологии и гистологии биофака МГУ имени М.В. Ломоносова
Источник
В лаборатории вырастили мини-мозг с глазами
Около 72 процентов органоидов мозга образовали зрительные пузырьки – выступающие из переднего мозга эмбриона мешочки, из которых впоследствии развиваются глаза.
Фото Cell.com.
Примерно на 30-й день жизни органоиды мозга конструируют зрительные пузырьки, которые постепенно развиваются в видимые структуры в течение следующих 60 дней.
Иллюстрация Cell Stem Cell.
Команда ученых из нескольких немецких университетов вырастила органоид мозга – мини-версию мозга. Органоид затем сам «сконструировал» зрительные пузырьки, из которых развились клетки тканей глаза. Статью об этом исследователи опубликовали в научном журнале Cell Stem Cell.
Напомним, органоидом называют миниатюризированный и упрощенный вариант органа, выращенный в пробирке в трехмерном виде. Органоиды выращивают из стволовых клеток, которые обладают способностью превращаться в клетки разных тканей и органов.
Для создания органоидов мозга исследователи использовали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Чтобы их получить, клетки кожи взрослых доноров с помощью «перепрограммирования» генов превращают в стволовые плюрипотентные – то есть те, из которых можно вырастить клетки любого органа.
К примеру, для выращивания мини-мозга плюрипотентные стволовые клетки помещают в культуру, которая имитирует среду развивающегося мозга. Конечным результатом является трехмерная модель мозга размером с горошину, которую можно использовать для изучения развития мозга, его болезней или воздействия лекарств на него.
Органоиды мозга немецкие исследователи вырастили из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от четырех доноров. Таким образом удалось получить 314 органоидов мозга.
Около 72 процентов органоидов мозга образовали зрительные пузырьки – выступающие из переднего мозга эмбриона мешочки, из которых впоследствии развиваются глаза. Эти структуры начали появляться через 30 дней жизни мини-мозга и созревали в течение 60 дней. Они росли симметрично, парой, как в настоящем мозге эмбриона.
Но самое главное, эти зрительные пузырьки имели функции настоящего глаза. Они содержали разнообразные типы клеток сетчатки, которые формировали нейронные сети, реагировали на свет и посылали эти сигналы в мозг. В зрительных пузырьках органоида мозга формировалась также ткань хрусталика и роговицы.
Эти глазоподобные структуры в органоидах мозга исследователи назвали в своей научной статье органоидами глаза.
«Наша работа подчеркивает замечательную способность органоидов мозга генерировать примитивные сенсорные структуры, которые являются светочувствительными и содержат типы клеток, подобные тем, которые находятся в организме, – говорит Джей Гопалакришнан (Jay Gopalakrishnan) из Университета Дюссельдорфа, ведущий автор исследования. – Эти органоиды могут помочь изучить взаимодействие мозга и глаза во время эмбрионального развития, моделировать врожденные нарушения устройства сетчатки и генерировать специфические для пациента типы клеток сетчатки для персонализированного тестирования лекарств и трансплантационной терапии».
Правда, на пути реализации это прекрасного сценария стоит важное препятствие. Исследования органоидов мозга имеют свои этические ограничения. Пока выращенные в пробирке образцы мини-мозга остаются очень примитивными, считается, что они не обладают каким бы то ни было сознанием. Но если ученые создадут более совершенную структуру, близкую к настоящему человеческому мозгу, вполне возможно, что органоиды будут обладать какими-то формами сознания.
Так, предыдущие исследования уже обнаруживали мозговые волны внутри двухмесячных органоидов, и они оказались примерно эквивалентными таковым у недоношенных детей.
Сенсорная информация, такая как зрение, может быть ключевым компонентом сознания мозга, выращенного в пробирке. Это проблема, которая выходит за пределы просто научного знания.
Добавим, что ранее мы писали, как из стволовых клеток ученые впервые получили мышиный эмбрион с бьющимся сердцем и как здоровые стволовые клетки удалось вырастить «на бумаге». А еще мы рассказывали о том, как стволовые клетки вернули людям подвижность.
Больше интересных новостей науки и медицины вы найдёте в разделе «Наука» и «Медицина» на медиаплатформе «Смотрим».
Источник
Ученые планируют выращивать на МКС человеческие органы
Что происходит
- Исследователи из Космического центра Цюрихского университета совместно с Airbus 28 августа 2021 года в рамках полета по пополнению запасов отправили на МКС стволовые клетки человека для выращивания органоидов, — мини-копий человеческих органов.
- Проект получил название «3D органоиды в космосе». Он был разработан исследователями Цюрихского университета Оливером Ульрихом и Корой Тиль, которые изучили, как гравитация влияет на человеческие клетки. Команда Airbus Innovations, в свою очередь, разработала необходимое оборудование и обеспечивает доступ к МКС.
- Разработка проекта заняла у создателей три года, а 18 месяцев назад завершились подготовительные испытания на МКС, в рамках которых в условиях микрогравитации стволовые клетки человека превратились в органоподобные структуры, такие как печень, кости и хрящи.
- Исследователи отмечают, что на Земле выращивать трехмерные органоиды невозможно из-за силы земного притяжения.
- Если эксперимент увенчается успехом, в будущем будет запущено промышленное производство человеческих органоидов в условиях гравитации для дальнейшего использования в медицинских исследованиях.
Что это значит
В настоящее время наблюдается усиленный интерес мирового научного сообщества к перспективам, которые предоставляет космос. Выращивание человеческих органов в условиях невесомости, — одно из многообещающих направлений в контексте изучения возможностей внеземного пространства.
Успешное проведение данного эксперимента станет настоящим прорывом для медицины. Во-первых, трехмерные органоиды представляют большой интерес для фармацевтических компаний, поскольку они позволяют проводить токсикологические исследования непосредственно на тканях человека, без необходимости проведения экспериментов на животных. Кроме того, в будущем органоиды, выращенные из стволовых клеток пациентов, могут быть использованы для трансплантации — возможно, это поможет удовлетворить мировой спрос на донорские органы.
В 2019 году NASA отправила на Международную космическую станцию биологический 3D-принтер для печати человеческих органов, а ранее в 2021 году на МКС был доставлен аппарат для 3D-печати из реголита в условиях Луны.
Источник
Была клетка простая, стала стволовая
20 февраля 2009
Была клетка простая, стала стволовая
Био+нано: мышиная эмбриональная стволовая клетка, выращиваемая на подложке, состоящей из нанотрубок
Автор
Редакторы
Стволовые клетки (СК) в последнее десятилетие стали притчей во языцех, источником, от которого ожидают вечной молодости и спасения от всех бед. Ожидания эти, скорее всего, немного преувеличены, но отнюдь не беспочвенны: где ещё увидишь такое чудо, чтобы из одной-единственной живой клетки получился полноценный орган, готовый для трансплантации донору! Во взрослом организме стволовых клеток в тысячи раз меньше, чем в эмбрионах, и с этим связан особый интерес к последним как к источнику «вечной молодости». К счастью, этическая проблема, связанная с неизбежным при «добыче» СК из эмбрионов разрушением только что зародившейся жизни, постепенно остаётся в прошлом: учёным удаётся всё более уверенно «перепрограммировать» соматические клетки в состояние, практически не отличимое от «стволового».
Исследования по стволовым клеткам перешли в тот разряд науки, о котором можно запросто прочитать в газете в руках у соседа, сидящего рядом с вами в метро. Интерес к этой тематике возник, конечно, не с пустого места: никогда ещё человечество не было так близко к извечно вожделенному бессмертию, как в век молекулярной биологии. (По крайней мере, так это представляется журналистам, пропагандирующим современные достижения «в народе».) С помощью стволовых клеток нам обещают как минимум излечение от большинства болезней, регенерацию органов, трансплантацию без отторжения, персональную медицину, и, конечно, молодость и красоту. И эти обещания отнюдь не беспочвенны: чего стоит хотя бы эксперимент, в котором стволовые клетки, используя в качестве строительных лесов каркас сéрдца мёртвой крысы, состоящий лишь из соединительной ткани, полностью достраивают орган до вновь рабочего состояния [1]! Или, например, очень хороша другая работа, в которой эмбриональные стволовые клетки развились в сферическое двухмиллиметровое образование из нервной ткани, очень напоминающее мозг на ранних стадиях развития [2]. А ведь кроме представляющейся пока совершенно фантастической индустрии выращивания для себя «запасных» органов, можно назвать и более прозаические применения: например, терапия стволовыми клетками сердечной ткани после инфаркта, позволяющая избавиться от рубца в миокарде, оставшегося бы иначе до конца жизни. Кроме собственно лечения больных, стволовые клетки найдут (и уже находят) применение в области тестирования новых лекарств на эффективность и токсичность, а также для изучения редких генетических заболеваний на специальных «моделях», созданных при помощи СК. Смело в будущее смотрят и многие косметологи: уже сейчас нередко встретишь заявления о чудесах, производимых каким-то омолаживающим средством, в основе которого лежат стволовые клетки! (Правда, кажется, недавно одно из таких средств было отозвано, поскольку на основании независимой экспертизы было признано жульническим.) Оставив эти заявления на совести производителей подобной косметики, можно, тем не менее, с полной уверенностью сказать, что стволовые клетки ожидает большое будущее и в науке, и в медицине, и в индустрии красоты.
Термин «стволовая клетка» (СК) был введён в науку не вчера: на заседании Общества гематологов, состоявшемся 1 июня 1909 года в Берлине, русский гистолог Александр Максимов назвал так клетки крови, которые способны дать начало нескольким другим типам клеток. (В связи с тем, что в те времена официальным языком науки был немецкий, а не английский, как сейчас, это слово звучало как “Stammzelle”.) В 60-е годы было продемонстрировано образование колоний многочисленных дифференцированных клеток из клеток костного мозга, а в 1981-м году американский биолог Мартин Эванс впервые выделил недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки из эмбриобласта мыши. В 1998 году Томпсоном и Герхартом была получена первая бессмертная линия эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека. В 1999 году журнал Science признал открытие стволовых клеток третьим по значимости событием в биологии после расшифровки двойной спирали ДНК и программы «Геном человека».
Корнем иерархии стволовых клеток (да и всех остальных клеток организма тоже) является зигота — самая первая клетка, являющаяся продуктом слияния яйцеклетки и сперматозоида. Зиготу и несколько её поколений (в течение первых нескольких дней эмбрионального развития) называют тотипотентной клеткой, то есть способной дать начало абсолютно любой ткани и органу, да и всему организму. (Кстати, однояйцевые близнецы — это как раз случай, когда зигота даёт начало не одному, а сразу двум или нескольким, генетически идентичным, организмам.) Ветвями иерархии являются плюрипотентные и мультипотентные (бластные) стволовые клетки, а «листьями» — зрелые дифференцированные (унипотентные) клетки тканей организма. Зрелые клетки запрограммированы на ограниченное количество циклов деления, после чего они умирают, замещаясь новыми поколениями; стволовые клетки такого ограничения не имеют и могут делиться бесконечно, поддерживая пулы стволовых и дифференцированных клеток. Впрочем, с возрастом популяция стволовых клеток сокращается: если в эмбриональном развитии одна ЭСК приходится на 10000 дифференцированных клеток, то у человека 60–80 лет — уже одна СК на 5–8 миллионов.
Генетически все клетки организма (кроме половых) идентичны друг другу , а вся разница в их строении и, следовательно, функциях (а также способности делиться и дифференцироваться) определяется режимом работы (экспрессии) генов, различающимся в клетках разных тканей. Дифференцировка клеток управляется цитокинами — химическими сигналами (молекулами), выделяемыми другими клетками.
Строго говоря, это не совсем так (у эритроцитов вообще нет ядра, у некоторых организмов геномы соматических клеток подвергаются значительным «сокращениям», мобильные элементы генома в разных клетках могут перемещаться по-разному), но мы сейчас на этом останавливаться не будем.
Итак, наиболее существенными характеристиками стволовых клеток (для определённости возьмём ЭСК) являются:
- Тотипотентность — способность развиваться в клетку любой из более чем 350 тканей организма;
- Хоуминг — способность «ощущать» градиенты хемокинов и мигрировать в зону повреждения или активного деления, восстанавливая поражённые участки или принимая участие в развитии;
- Избыточность экспрессии генов — в цитоплазме одновременно находится более 3000 мРНК, которые могут потребоваться только на более поздних стадиях развития зародыша;
- Теломеразная активность. При репликации ДНК концевые участки хромосом (теломеры) неконтролируемо укорачиваются, в конце концов затрагивая и повреждая структуру генов — что может быть одним из естественных механизмов ограничения числа циклов деления и даже причиной старения вообще. Однако в стволовых клетках действует теломераза — фермент, удлиняющий теломеры и тем снимающий ограничения по делению. (В этом смысле стволовые клетки очень похожи на раковые, которые также способны неограниченно делиться, — только последние отнюдь не способствуют долголетию.)
Чем плохи эмбриональные стволовые клетки?
Как уже было сказано во введении, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) являются идеальным образцом тотипотентности, то есть неограниченной способности к делению и дифференцировке. Однако если рассуждать с прицелом на практические применения — такие как регенеративная медицина или выращивание «запасных» тканей и органов — то главным ограничением в исследованиях становится хорошо известная этическая проблема, связанная с ЭСК: чтобы получить их, надо «отщипнуть» кусочек от эмбриона, почти наверняка прервав зарождающуюся жизнь. Проблема эта стоит настолько остро и имеет такие строгие законодательные ограничения, что исследователи часто не могут работать с человеческими ЭСК, даже если для этого не нужно совершать ничего аморального: если, например, в качестве образцов использовать не потребовавшиеся при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) зародыши, заручившись на то согласием пациентов. Особенно суров на этот счёт закон США: Джордж Буш лично запретил, дважды воспользовавшись правом вето в конгрессе, государственное финансирование любым работам, в которых могут быть разрушены человеческие эмбрионы.
Впрочем, новый президент США Барак Обама, видимо, уже дал законодательное послабление: летом 2009 года начнутся первые испытания по применению стволовых клеток для лечения больных. Около десяти парализованных пациентов в одной из американских клиник получат спинномозговую инъекцию стволовых клеток — предшественников олигодендроцитов (один из типов клеток центральной нервной системы). Этот метод уже был опробован на лабораторных животных, и через полгода станет ясно, поможет ли он людям [3].
Недавно появились данные, что ЭСК можно получать из зародышей, не разрушая их: если от эмбриона на стадии четырёх или восьми клеток отделить один из бластомеров, то из него можно получить линию ЭСК, а зародыш тем временем продолжит развитие, по крайней мере, до стадии бластоцисты [4]. (Дальнейшее наблюдение не проводилось исходя из всё тех же этических соображений.) И хотя, очевидно, способ не повреждающего эмбрионы получения ЭСК существует — ведь описанная процедура практически ничем не отличается от изъятия одного бластомера для генетического скрининга при ЭКО, — многочисленные этические проблемы и сопротивление общественного мнения вряд ли обещают этой методике большое будущее.
Скорее всего, прогнозируемый в ближайшее десятилетие прорыв в передовой медицине, связанный со стволовыми клетками, будет основан не на ЭСК, а на так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК, от Induced Pluripotent Stem Cell) — обычных дифференцированных зрелых клетках, перепрограммированных в состояние плюрипотентности.
Сюрпризы стволовых клеток
Л. И. Корочкин — крупнейший русский биолог, один из основателей генетики развития и видный специалист по стволовым клеткам — в 2005 году писал в популярной статье о стволовых клетках: «. изучение поведения стволовых клеток не поколебало представлений о стабильности и необратимости клеточной дифференцировки: из фиброцита, плазматической или из париетальной клетки желудка никогда не получится нейрон, а из нейрона не возникнет кожная клетка. На стадии терминальной дифференцировки клетка обретает стабильное состояние и теряет способность к делению и разного рода превращениям» [5]. Всего одного года Леонид Иванович не дожил до события, которое, несомненно, поразило бы его до глубины души: в 2007 году в поле зрения журнала Science, опять опубликовавшего рейтинг важнейших открытий (на этот раз — только за истекший год), попало две работы, в которых докладывалось о получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из зрелых, дифференцированных клеток — при помощи своего рода генетического перепрограммирования (см. врезку).
Транскрипционные факторы и гены, участвующие в работе стволовых клеток
Oct3/4 (Octamer-binding transcription factor 4) — белковый транскрипционный фактор (ТФ) семейства гомеобокс, играющий ключевую роль в раннем эмбриональном развитии. Необходим для поддержания плюрипотентности стволовых клеток. Нарушение его работы приводит к тому, что на стадии бластоцисты не формируется эмбриобласт, а это ведёт к ранней летальности. Во взрослом организме этот ген практически неактивен, за исключением некоторых стволовых популяций и опухолевых клеток.
Sox2 (SRY [sex determining region Y]-box 2) — белковый ТФ семейства SOX, связывающийся с малой бороздкой ДНК и также играющий решающую роль в раннем эмбриональном развитии и самоподдержании популяции СК. Мутация этого гена приводит к врождённым порокам развития, таким как отсутствие одного или обоих глаз.
NANÓG — ещё один гомеобоксный ТФ, лежащий в основе плюрипотентности. «Выключение» этого гена приводит к запуску дифференцировки СК. Первооткрыватель этого фактора шотландец Йэн Чемберс (Ian Chambers) так говорит об истории его наименования: «Похоже, Nanog — один из основных генов, определяющих возможности стволовых клеток по неограниченному росту в лаборатории и в организме. Поскольку я шотландец, я назову этот ген в честь старинной легенды о Тир-На-Ноге. ». (Тир-На-Ног (иногда Тир-На-Ног’т) — земля вечной молодости в кельтской мифологии.)
c-Myc — протоонкоген, ДНК-связывающий ТФ, отвечающий за регуляцию около 15% всех генов. Мутации в этом гене приводят к развитию разнообразных форм онкогенных заболеваний. Кроме прямого связывания с ДНК, c-Myc ещё влияет на работу гистон-ацетилтрансферазы — фермента, модифицирующего структуру хроматина и, следовательно, также управляющего экспрессией генов. Кроме инициации «стволового» фенотипа, c-Myc принимает участие в таких процессах как дифференциация, клеточный рост и апоптоз.
Klf-4 (Krüppel—like factor 4) — ТФ семейства, названного так из-за гомологии с регуляторным белком дрозофилы Krüppel. В зависимости от обстановки, Klf-4 может быть как активатором, так и супрессором генов; он экспрессируется в дифференцирующихся клетках эпителия и при сосудистых поражениях.
Lin28 — ещё один маркер активности стволовых клеток — мРНК-связывающий и микро-РНК регулируемый белок, способный селективно усиливать трансляцию мРНК. В частности, при его участии проходит синтез инсулиноподобного фактора роста (IGF2), очень важного в эмбриональном развитии и в формировании мышц. Активность гена наблюдается в эмбриональных тканях, стволовых клетках и мышцах и миокарде во взрослом организме.
Пионером в этой области можно считать японского биолога Шинью Яманаку (Shinya Yamanaka) из Университета Киото, группа которого первой сообщила о своих результатах в журнале Cell [6]. Исследователям удалось превратить фибробласты из кожи человека в клетки, очень напоминающие ЭСК по морфологии, экспрессии генов и способности к дифференцировке. Сделано это было при помощи ретровирусной интеграции (или, как говорят, трансфекции) в геном фибробластов четырёх транскрипционных факторов (ТФ) — Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc (см. врезку выше), изменяющих активность генов и тем самым весь облик и поведение клетки. В случае успешной трансфекции фибробласты через несколько дней начинают менять форму и образовывать колонии клеток, морфологически идентичные колониям ЭСК, перестают синтезировать характерные для фибробластов белки (такие как компонент промежуточных филаментов виментин), и начинают синтезировать факторы роста и дифференциации, характерные исключительно для стволовых клеток (Sox2, NANOG, REX1, FGF4 и другие). Анализ деметилирования промоторов «эмбриональных» генов, а также «гистонового кода» — известных механизмов регуляции экспрессии генов (см. врезку) — также подтвердил, что генетическая активность индуцированных СК перестроена по «эмбриональному» типу. В целом профиль экспрессии генов, определённый с помощью технологии микрочипа (microarray), оказался очень похожим (хотя и не идентичным) на ЭСК. Отдельно следует упомянуть о «включении» гена теломеразы — фермента, обеспечивающего «бессмертие» СК.
Строго говоря, первой была не эта их статья, но именно она отмечена в Science.
Гистоновый код и метилирование ДНК
ДНК в хромосоме плотно упакована, что достигается путём «наматывания» молекулы ДНК на «бобину» из белковых молекул — гистонов. Как сама молекула ДНК, так и белки-гистоны несут особые химические «метки», маркирующие данный участок хромосомы как активный (экспрессия генов разрешена) или неактивный (репрессированный). Узнавание нужных участков хромосомы и распределение на этом участке меток осуществляется широким спектром различных ферментов в составе крупных белковых комплексов. Такие комплексы порой содержат молекулы коротких РНК, которые нацеливают комплекс на участок ДНК, комплементарный последовательности короткой РНК.
Метилирование ДНК по цитозиновым основаниям без изменения самой последовательности нуклеотидов является одним из механизмов эпигенетического регулирования активности генов; оно производится ферментами, носящими название ДНК-метилтрансфераз. Гистоны же имеют на поверхности множество заряженных аминокислотных остатков (таких как лизин или глутаминовая кислота), которые могут подвергаться разнообразным модификациям — метилированию, фосфорилированию, ацетилированию и другим. Система этих модификаций чрезвычайно важна для регуляции активности генов, и даже получила название «гистоновый код» [8].
Чтобы «помочь» клеткам перестроиться на новый лад, их культивируют в среде особого состава, заменяя её через какое-то время на смесь, оптимизированную специально для стволовых клеток. Всего описанная последовательность действий заняла 25 дней, и из
5×10 4 фибробластов удалось получить 10 колоний ИПСК — «выход» оказывается таким низким не только из-за небольшой эффективности трансфекции, но и из-за менее хорошо осознанных факторов, связанных с экспрессией генов.
Чтобы убедиться, что полученные клетки действительно обладают широкой способностью к дифференциации, было продемонстрировано их превращение в клетки всех трёх зародышевых листков — в частности, в нервные клетки или кардиомиоциты, демонстрирующие в культуре биение (способность к коллективному восприятию электрического стимула и реакции на него). Кроме того, тотипотентные свойства ИПСК были проиллюстрированы на примере образования опухолей — тератом — у инъецированных этими клетками мышей с генетически ослабленным иммунитетом (это является стандартным «тестом на стволовую клетку»).
Механизм действия этой «магической комбинации» перепрограммирующих белков до конца ещё не понятен, однако известно, что два из использованных факторов — Oct3/4 и Sox2 — лежат в основе плюрипотентности стволовых клеток, активно работая именно в них (но не в соматических клетках). Они активируют «стволовые и эмбриональные» гены в клетке, заставляя гены, отвечающие за специализацию, наоборот, сократить свою активность. Известно также, что эти белки не могут запустить превращение зрелой клетки самостоятельно — видимо, из-за метилирования промоторов соответствующих генов и модификаций гистонов, на которых «накручена» ДНК хромосом. По одной из гипотез, два других фактора — c-Myc и Klf4 — модифицируют структуру хроматина, давая доступ к промоторам генов. Это тем более вероятно, что Klf4 может регулировать активность ацетилтрансферазы гистонов (фермента, «навешивающего» ацетильную метку на «бобину» гистона) и тем самым влиять на экспрессию генов.
Интересно, что в уже окончательно «де-дифференцировавшихся» стволовых клетках активность генов, доставленных с помощью ретровирусных векторов и вызвавших это превращение, сильно падает, и, похоже, больше не требуется для поддержания ИПСК в «стволовом» состоянии. Это обстоятельство позволяет надеяться, что удастся найти способ перепрограммировать зрелые клетки в состояние тотипотентности без интеграции в ДНК транскрипционных факторов под управлением вирусных промоторов, два из которых, использованных Яманакой, являются протоонкогенами: c-Myc и Klf4. И хотя после «перепрограммирования» эти гены вроде бы «замолкают», около 20% мышей, полученных из стволовых клеток , в геноме которых содержатся введённые извне c-Myc и Klf4, страдают опухолевыми заболеваниями, что, хотя бы отчасти, вызывается повторной активацией этих генов.
«Выращивание» мышей из стволовых клеток путём подсаживания их в эмбрион и последующего скрещивания «мозаичных» мышей для получения чистых трансгенных линий — метод, отмеченный Нобелевской премией 2007 года [7] как получивший чрезвычайно широкое распространение в молекулярной биологии.
Необходимо отметить, что и c-Myc, и Klf-4 — это гены, в норме присутствующие в ДНК клетки, но в постнатальном периоде в основном неактивные. Доставка и интеграция дополнительных их копий с помощью ретровирусного вектора требуется, чтобы вызвать суперэкспрессию, поскольку вирусные промоторы как раз «заточены» для этого, хотя по тем же причинам и плохо управляемы (что, в конечном счёте, и является причиной онкогенности).
Дополнительным источником мутаций может служить интеграция генетического материала в ДНК человеческих клеток (путём рекомбинации с хромосомами), и, скорее всего, пока не будет найден способ перепрограммировать клетки без трансфекции — только за счёт разовой обработки набором каких-либо факторов — использование таких СК в медицине будет очень ограничено.
Обойдёмся без онкогенов
Учёные хорошо понимают, что успех разрабатываемых ими технологий перепрограммирования соматических клеток в стволовые зависит от того, насколько безопасным будет их применение. В первую очередь опасения тут касаются, конечно, онкогенного действия генов c-Myc и Klf4, и необходимости что-то встраивать в геном клетки, от которой в дальнейшем будет зависеть жизнь человека.
Всего несколько месяцев спустя Яманака и его группа докладывают о том, что им удалось получить стволовые клетки без одного из онкогенов, который они использовали раньше, — c-Myc [9]. Оказалось, что если дать клеткам больше времени, то перепрограммирование проходит и без этого ТФ, хоть и со значительно более низкой эффективностью. (В первой упомянутой работе учёные проводили скрининг культуры на предмет новообразованных колоний ИПСК через 7 дней после трансфекции, во второй — через 14.) Как и ожидалось, выращенные из этих стволовых клеток мыши уже не были столь подвержены образованию опухолей: за время наблюдения не было зарегистрировано ни одного такого случая. Однако, несмотря на то, что трансфекция в этом случае производилась набором из трёх факторов (а не четырёх), один из них всё-таки по-прежнему является протоонкогеном — Klf4, — да и эффективность получения ИПСК значительно снизилась (примерно в 20 раз, что в абсолютных цифрах составляет
Ещё в одном исследовании, вместе с работой Яманаки отмеченном в Science как один из «прорывов» 2007 года, учёные независимо добились сходных результатов — индуцировали превращение фибробластов человека в стволовые клетки, по основным параметрам практически неотличимые от ЭСК [10]. В этой работе использовались другие индуцирующие факторы, комбинацию которых подобрали из набора генов, активных только в эмбриогенезе и в культурах стволовых клеток. Из списка «претендентов» заранее исключили c-Myc и Klf-4, чтобы попытаться обойтись без протоонкогенов, из 14 оставшихся вариантов удалось выбрать четыре гена, достаточных для «превращения»: два из них были теми же, что и в работе Яманаки — Sox2 и Oct4, — а два оставшихся отличались: NANOG и LIN28 (см. врезку). Учёные показали, что активность генов Oct4 и Sox2 абсолютно необходима для перепрограммирования, в то время как без NANOG или LIN28 удавалось обойтись (с существенной потерей эффективности и замедлением процесса). Само собой, во всех случаях проводилось морфологическое, геномное и гистологическое подтверждение, что получены именно стволовые клетки, а не что-то другое, и что получены они именно из соматических предшественников, а не из случайно оказавшихся в чашке других стволовых клеток.
Питательная среда, в которой культивируются клетки, может оказывать не меньшее влияние на ход перепрограммирования, чем белки-индукторы плюрипотентности. Так, совсем недавно обнаружилось, что низкомолекулярное соединение вальпроевая кислота, часто используемая как лекарство против эпилепсии, может применяться вместо онкогенного фактора Klf-4 при получении ИПСК [11]. При добавлении в среду, в которой выращивали фибробласты человека, вальпроевой кислоты и трёх ТФ — Sox2, Oct4 и Klf-4 — перепрограммирование идёт с тысячекратным увеличением эффективности (т. е. в стволовые превращается уже 1% клеток). При исключении из «протокола перепрограммирования» Klf-4 эффективность возвращается снова в диапазон 0.001–0.01%, но это уже без интеграции в хромосому ДНК гена, потенциально способного вызвать злокачественное перерождение. Вальпроевая кислота — маленькая органическая молекула, которая, оказав определённое действие, будет выведена из клетки, — оказывается способной заменить собой ретровирусный вектор, интегрирующийся в геном и продуцирующий потенциально опасный белок-регулятор. Объясняется действие вальпроевой кислоты тем, что она является ингибитором гистон-ацетилтрансферазы и ДНК-метилтрансферазы — ферментов, редактирующих структуру хроматина и отвечающих за активность генов (см. врезку). Klf-4 тоже оказывает влияние на эти белки, что, видимо, и обуславливает их взаимозаменяемость. Этот факт подкрепляет надежду, что в конце концов удастся получить стволовые клетки без использования ретровирусной трансфекции.
Стволовые клетки из вóлоса
В большей части упомянутых исследований ИПСК получали путём перепрограммирования фибробластов (в случае исследований на человеческих клетках), а для мышей были успешные примеры и для нейронов. Но недавно Хуану Карлосу Бельмонте (Juan Carlos Belmonte) из Института биологических исследований Солка в Калифорнии и объединённой группе итальянских и испанских биологов удалось показать, что кератиноциты — клетки рогового слоя и волос — значительно лучше подходят для перепрограммирования, чем «привычные» фибробласты. В своей работе (правда, использовался «полный» набор индукторов — Oct4, Sox2, Klf-4 и c-Myc) они продемонстрировали стократное увеличение эффективности перепрограммирования при сокращении длительности эксперимента вдвое [12]. (Уже на 6–7 день после трансфекции появлялись первые колонии ИПСК, практически неотличимые от эмбриональных СК.)
«При условии доступности эффективного и практически приемлемого метода получения стволовых клеток, специфичных для каждого пациента — а эти условия явно не выполняются в случае эмбриональных стволовых клеток, — клеточная терапия и трансплантация не будут вызывать отторжения иммунной системой, что значительно приблизит нас к реальному применению стволовых клеток в клинике», — говорит Бельмонте, который по совместительству является директором Центра регенеративной медицины в Барселоне [13].
Учёные объясняют такую высокую эффективность перепрограммирования не столько выбранной ими системой и протоколом ретровирусной трансфекции, сколько выбором именно кератиноцитов в качестве объекта для «превращений». Проведённый ими статистический анализ профилей генетической активности фибробластов, кератиноцитов и ЭСК позволил заключить, что кератиноциты в каком-то смысле «ближе» к стволовым клеткам, вследствие чего для них требуется меньше усилий, чтобы перестроиться на плюрипотентный фенотип. (В частности базальный («собственный») уровень экспрессии генов c-Myc и Klf-4 у них существенно выше, чем у фибробластов, ставя их «ближе» к ЭСК и объясняя бóльшую лёгкость перестройки.)
В своей работе биологи продемонстрировали эффективность предложенной ими методики как нельзя более изящно: вместо использования культур клеток, чашек Петри и прочего сугубо лабораторного реквизита, они взяли просто волос с головы одной из участниц исследования, и продемонстрировали образование ИПСК в области стержня волоса (а не луковицы; рис. 1). Этот эксперимент подтверждает, что исследователи наблюдали именно перепрограммирование кератиноцитов, а не разрастание колоний СК, присутствующих в корне волоса (хотя косвенное их влияние и не исключено). Полученные клетки, как и положено, дифференцировались в представителей зрелых специализированных клеток всех трёх зародышевых листков, включая дофаминегрические нейроны (рис. 2) и кардиомиоциты, совершающие коллективные биения в культуре (видео). При «де-дифференцировке» клетки начисто «забывали» свой прежний облик и переставали синтезировать маркерный белок кератиноцитов — кератин-14 — и «включали» гены, характерные для стволовых клеток и эмбриональных тканей.
«Почему именно кератиноциты оказались наиболее податливыми к перепрограммированию, чем все остальные клетки из массы, перепробованной нами — это большой вопрос, — говорит Бельмонте [13]. — Однако знание этой причины чрезвычайно важно для дальнейшего развития и науки, и технологии».
Рисунок 1. Получение и характеристика индуцированных плюрипотентных клеток из кератиноцитов (КиПСК). а — Волос из кожи головы человека, помещённый на желатинообразную питательную среду матригель, смоченную средой, предназначенной для культивирования стволовых клеток. б — Разрастание кератиноцитов в питательной среде со ствола волоса (но не с луковицы) становится отчётливо заметным через 5 дней. Через три дня после этого кератиноциты «пересадили» в отдельную чашку, ещё через три дня — трансфецировали ретровирусной конструкцией, содержащей гены Oct4, Sox2, Klf-4 и c-Myc. в — Через какое-то время появляются колонии клеток с типичной для СК морфологией; эти колонии снимают со среды и переносят на «подложку» из фибробластов. г — Одна из колоний КиПСК через 10 дней после «пересаживания». д — На этом этапе колонии стволовых клеток, обладающие повышенной активностью щелочной фосфатазы (синяя окраска) уже практически неотличимы и от ЭСК, и от любых других ИПСК. е–к — иммунофлуоресцентный анализ показывает, что КиПСК экспрессируют все типичные для стволовых клеток маркеры, включая SSEA3, SSEA4, OCT4, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81.
Рисунок 2. КиПС клетки дифференцируются в ткани всех трёх зародышевых листков как in vitro, так и in vivo. а — Дифференциация в среде стромальных клеток линии PA6 при добавлении фактора роста фибробластов FGF-8 и гомолога белка Sonic Hedgehog (SHH) приводит к образованию дофаминергических нейронов с типичной морфологией и экспрессией маркера нервной ткани TuJ1 (зелёный) и маркера дофаминергических нейронов тирозингидроксилазы (красный). б–д — Примеры дифференциации по этому типу. е–и — Спонтанную дифференциацию сразу во все три зародышевых листка удаётся наблюдать на срезах тератом (опухолей, образующихся у мышей с генетически ослабленным иммунитетом при инъекции стволовых клеток) при окраске по принятым в гистологии гемотоксилину/эозину (е) или иммуногистохимическим способом. Флуоресцентное мечение на TuJ1 (ж), α-фетопротеин (з) и α-актинин (и) позволяет идентифицировать эктодерму, эндодерму и мезодерму, соответственно.
Видео. Биение кардиомиоцита, развившегося из стволовой клетки, полученной путём «перепрограммирования» клетки человеческого волоса (кератиноцита)
Стволовые клетки без трансфекции
Исследования в области получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из «обычных» соматических идут семимильными шагами, и уже не остаётся сомнения, что вскоре эта задача будет решена окончательно. (Правда, останется намного более фундаментальная проблема: как полученными ИПСК пользоваться!) Так, например, совсем недавно группа учёных из Исследовательского института Скриппса (Калифорния, США) и Института молекулярной биомедицины имени Макса Планка (Мюнстер, Германия) сообщила, что им удалось получить СК с использованием всего двух ТФ, заменив остальные низкомолекулярными веществами. Однако самое интересное заключается в том, что в списке «замещённых» генов числится Sox2, который считался абсолютно необходимым для перепрограммирования [14]!
«Наша работа доказывает, в конце концов нам удастся перепрограммировать соматические клетки в стволовые только при помощи химической обработки, и вообще без генетических манипуляций, — говорит Шенг Динг (Sheng Ding), профессор кафедры химии в институте Скриппса и руководитель исследования [15]. — Учитывая вклад ряда других рабочих групп, с уверенностью можно сказать, что технология клеточного перепрограммирования вскоре станет неотъемлемой частью практически важных приложений».
Коллектив, возглавляемый Дингом, открыл два низкомолекулярных гетероциклических соединения, которые позволяют провести перепрограммирование без интеграции гена Sox2. «Действующее вещество» этой пары — известное под кодовым названием BIX — является (как и вальпроевая кислота, речь о которой уже шла) ингибитором гистон-ацетилтрансферазы и ДНК-метилтрансферазы — ферментов-регуляторов структуры хроматина и активности генов. Однако сам по себе BIX обеспечивает очень низкую эффективность перепрограммирования, и учёным посчастливилось идентифицировать второе соединение — известное под шифром BayK8644 — которое, никак само не влияя на активность генов (!) и являясь агонистом кальциевых каналов мембраны клетки, позволяет существенно увеличить выход процесса. Почему это происходит, пока ещё точно не известно.
«Нам пока что не удалось установить точный механизм, по которому BayK ускоряет перепрограммирование, — признался Динг [15]. — Мы не ожидали открыть, что маленькая молекула, влияющая на передачу сигналов и, вроде бы, никак не связанная с плюрипотентностью, может так её „катализировать“. Это может в дальнейшем позволить перепрограммировать клетку без нарушения её генетической целостности прямо in vivo».
Ну и напоследок следует рассказать о совсем свежей работе группы Яманаки, которой, похоже, удалось-таки осуществить клеточное перепрограммирование без интеграции ретровирусов в геном [16]. Вместо ретровируса исследователи использовали аденовирус, на основе которого соорудили две плазмиды — одну с генами Oct3/4, Sox2 и Klf-4, а другую с геном c-Myc, — и разработали протокол повторной обработки этими плазмидами клеток (на 1-й, 3-й, 5-й и 7-й дни после начала перепрограммирования), позволивший через 10 дней получить первые колонии ИПСК, в геноме которых нет следов интеграции вирусного материала. (По крайней мере, их не удалось обнаружить, как бы тщательно не производился анализ.) Повторная обработка требуется, поскольку гены в данном методе доставки не интегрируются в хромосомы, а, следовательно, их продукт появляется в клетке лишь ненадолго. И, конечно, самое выгодное в таком способе — что геном уже «готовых» стволовых клеток остаётся неизменённым. Кстати, в начале 2009 г. уже появилось несколько работ, в которых сообщается об успешном перепрограммировании соматических клеток с использованием только одного вирусного вектора, несущего все необходимые для превращения гены.
Пока что эффективность подобного перепрограммирования, опять-таки, существенно ниже, чем при использовании ретровирусов, да и сам принцип был продемонстрирован не на клетках взрослого человека, а на эмбриональных фибробластах мыши. Однако первый недостаток, возможно, связан всего лишь с более низким уровнем экспрессии генов с плазмиды, чем с встроенного в хромосому фрагмента ДНК, — и в этом случае наверняка удастся найти выход путём оптимизации протокола обработки клеток. А в том, что и на человеческих клетках удастся сделать то же самое — уже и сомневаться не приходится.
Заключение
Перспективность исследований в области стволовых клеток ни у кого не вызывает сомнений — не даром известный южнокорейский учёный У Сук Хван (Woo Suk Hwang), в надежде закрепить свой приоритет в этой области, не удержался от соблазна и опубликовал в 2005 году в Science преднамеренно фальсифицированные результаты относительно получения ЭСК путём «пересадки» ядра соматической клетки в неоплодотворённую яйцеклетку, а не из безжизненного эмбриона. Подтасовка в такой активно развивающейся области была, конечно, очень скоро обнаружена [17], и репутация исследователя теперь безнадёжно испорчена, но область в целом с тех пор существенно продвинулась вперёд, и, как видно из этого обзора, учёные уже практически стоят на пороге технологии получения стволовых клеток, которая устроила бы всех. (За исключением, конечно, только самых ярых противников любых молекулярно-генетических работ, являющихся по некоторым данным смертным грехом [18].)
И — уже в который раз — работы, связанные со стволовыми клетками, называют прорывом года. По версии журнала Science, как и многих других изданий, «перепрограммирование» соматических клеток в стволовые (и в соматические клетки другого типа, минуя «стволовую» стадию), открытие специфики кератиноцитов в этом отношении и первые работы, позволяющие обходиться без модификации генома, — это одни из самых важных достижений 2008 года [19].
Однако самое интересное ещё, конечно, впереди: мало получить ИПСК и на модельной системе продемонстрировать, что стволовые клетки могут формировать органы, — надо ещё научиться эти органы трансплантировать нуждающимся в этом пациентам. По данным лабораторных исследований, иммунологического отторжения не должно происходить, однако реальность всегда вносит свои коррективы, и задача может оказаться намного сложнее, чем можно себе представить. Точно так же, пока стволовые клетки смогут быть использованы в «омолаживающих» косметических продуктах, наверняка придётся преодолеть ещё массу сложностей и убедительно доказать, что игра с таким мощным инструментом, как стволовая клетка, не причинит вреда здоровью человека (например, ни при каких условиях не запустит процесс возникновения опухоли).
Первая ниша, которую стволовые клетки займут в практически важной деятельности уже в самое ближайшее время — это изучение редких генетических заболеваний на культурах СК, обладающих генотипом, обуславливающим болезнь. Многие болезни не удаётся как следует изучить оттого, что они крайне редко встречаются, и пациентов с этим заболеванием оказывается по ряду причин не просто привлечь к исследованию. Создание «моделей» этих заболеваний, основанных на стволовых клетках, позволит преодолеть это ограничение и более подробно изучить болезни.
Стволовые клетки найдут применение и в области тестирования лекарств и других биологических препаратов, позволяя быстро и эффективно исследовать влияние различных веществ на клетки различных типов, предсказывая тем самым спектр активности будущего препарата в разных тканях и органах.
Нейродегенеративные заболевания, такие как болезни Паркинсона и Альцгеймера, тоже «дожидаются» пришествия стволовых клеток — существуют обнадёживающие данные, что они позволят значительно сдерживать заболевание и даже обращать вспять вызванные им разрушительные изменения.
Первоначально статья была опубликована в журнале «Косметика и медицина» [20].
Источник